基因操作及其医学应用

GENEMANIPULATIONANDITSAPPLICATIONINMEDICALPRACTICE基因操作及其医学应用鲍朗一、基因操作的基本战略1.概述2．基因和DNA的近代概念3.基因操作的基本内容和程序内容提纲二、转基因和基因治疗1．概念和研究现状2．基因治疗的基本类型3．转基因的基本方法4.转基因的表达和调控5．基因治疗的运用和前景内容提纲基因操作的基本战略理论三大发现★生物遗传物质是DNA(Avery，U.S.A．1934)★DNA双螺旋模型(Watson,C.S.H.CrickC.B.1953)★遗传中心法则(Nirenberg，1961-1966)概述基因操作的基本战略技术上的三大发明★限制性内切酶(Smithetal.1970)★载体(Cohen1973)★逆转录机制(Baltimore1970)概述基因操作的基本战略概述基因操作的基本战略EcoRI起始42bp终止BamHI培养液（9升）基因工程SMT=羊脑SMT50mg50万头ATCTGATAGEcoRIBamHIPlasmidSMTr-PlasmidE.coli基因工程生长激素释放抑制素(SMT)示意图基因操作的基本战略概述基因操作的定义：在基因水平上进行人工操作并改变其生物遗传性的技术称基因操作。所采用的主要手段为DNA重组技术，主要程序是将DNA片段插入到质粒、病毒等载体中，形成遗传物质的新组合，然后转移到宿主细胞中扩增和表达。概述基因操作的基本战略脱氧核糖核酸和核苷酸双螺旋链的组成：腺嘌呤鸟嘌呤胸嘧啶胞嘧啶基因操作的基本战略+脱氧核糖+磷酸核苷酸脱氧核糖5’碳与相邻3’碳磷酸脂键共价成链两链平行反向，碱基互补，氢键连接呈双螺旋。DNADNA和基因的近代概念DNA和基因的近代概念DNA生化特性：

★碱基配对，5’-3’磷酸脂链共键

★DNA-RNA-Protein，半保留复制

★RNA:mRNA,tRNA,rRNA基因操作的基本战略原核：连续密码区对应mRNA→Protein原核细胞和真核细胞基因非编码区剪切真核：编码区编码区mRNAProtein

DNA和基因的近代概念intronexonexon基因操作的基本战略1．目的基因的获取

2．DNA体外重组

3．重组DNA的转化与增殖

4．阳性重组体的筛选探针PCR

5．目的基因的表达表达产物的应用

限制性内切酶

载体

分子杂交

基因操作的基本内容和程序基因操作的基本战略1.目的基因的获取1)基因库筛选、扩增:"Shotgun"限制性酶法，机械切割。2)逆转录法逆转录酶合成全长或近全长ds-cDNA．3)人工合成基因：小片段连接，PolymeraseChainReaction基因操作的基本内容和程序基因操作的基本战略2.DNA体外重组，1)Restrictionendonuclease(R．E)基因操作的基本内容和程序基因操作的基本战略Enzym:平头切割酶粘端切割酶异源同功酶SmaI–CCCGGGXmaI--CCCGGGBuffer:

高盐：pvUII,XhoI

中盐：BamHI,EcoRI,HindIII,PstI低盐：KpNI,SmaI基因操作的基本战略基因操作的基本内容和程序2)

Vectors：

必备条件:①较小分子量和松弛复制子

②基因组上有一到两个筛选标记

③有一到数个限制性内切酶位点理想条件：④插入失活筛选标记

基因操作的基本内容和程序基因操作的基本战略选择质粒载体用于分子克隆的要点:

★外源DNA大小

★限制性内切酶位点

★筛选标记的数量

★克隆的表达当前广泛应用的克隆质粒载体:PUC18，19．

基因操作的基本战略基因操作的基本内容和程序基因操作的基本战略基因操作的基本内容和程序3)目的基因片段与载体的连接

★粘末端法

★平接法

★接头法基因操作的基本内容和程序基因操作的基本战略3．重组DNA的转化与增殖制备CompetenceCell．C．Cell--

R.DNA——>”Hotshock”(42℃，2’)

——>L．B．Culture-->37℃，lhr．

-->LB．agar．plate-->genomiclibrary．基因操作的基本内容和程序基因操作的基本战略基因操作的基本内容和程序4.阳性重组体的筛选②颜色反应Lac+Polylinker+β-半乳糖苷酶Xgal蓝色/白色基因操作的基本战略利用基因操作的基本内容和程序基因操作的基本战略4.阳性重组体的筛选

①抗药基因抗Ampicilin基因Ampicilin敏感受体细胞

＋

Ampicilin培养基

↓未转化菌落不能存活基因操作的基本内容和程序4.阳性重组体的筛选②颜色反应Lac+Polylinker+β-半乳糖苷酶Xgal蓝色/白色基因操作的基本战略利用基因操作的基本内容和程序4.阳性重组体的筛选③影印原位杂交（SituHybridization)菌落ＤＮＡ

硝酸纤维滤膜阳性重组体基因操作的基本战略原位固定重组探针杂交基因操作的基本内容和程序4.阳性重组体的筛选④斑点杂交(DotBlots)已知重组DNA滤膜重组DNA同源性和特异性基因操作的基本战略方阵打点阳性重组DNA探针杂交基因操作的基本内容和程序4.阳性重组体的筛选⑤southern杂交DNA片段吸印重组探针杂交后处理基因操作的基本战略基因操作的基本战略基因操作的基本内容和程序5．外源基因表达

1)使用表达载体(强启动子LacUV5．Tac等)常用PEX系统，PKK系统等。2)外源基因克隆在原核强启动子(如Lac，trp，tａc等)和SD序列的下游。

3)不产生密码组移动。4)调整载体的起始密码和SD序列之间的距离。

5)减轻宿主细胞的代谢负荷，将宿主细胞的生长与重组DNA复制或表达分开，促进表达蛋白的分泌。基因操作的基本内容和程序基因操作的基本战略THANKYOUGENEMANIPUTATIONANDITSAPPLICATIONINMEDICALPRACTICE基因操作及其医学应用鲍朗转基因和基因治疗基因治疗是以正常的或野生型的基因插入靶细胞的染色质基因组中以替代或置换致病基因从而产生新表型的一种治疗方法。基因治疗必需具备目的基因、靶细胞以及将目的基因导入靶细胞的转基因方法，同时目的基因的表达以及对此表达的调控也是转基因治疗必不可少的条件。转基因及基因治疗基本概念转基因及基因治疗基因治疗的程序目的基因转基因基因表达基因治疗viralnonviralInvivoexvivo体内调控

★体内直接转基因治疗（inVivo）

★细胞介导的基因治疗(exVivo)

★体外表达基因治疗(inVitro)转基因及基因治疗基因治疗的基本类型1、病毒法(Viral)

1)逆转录病毒(Retrovirus)RNA病毒，结构缺陷PackagingCell转基因及基因治疗转基因的基本方法优势：

①整合率高;

②对外源DNA影响小;

③单拷贝整合，利于表达调控；

④安全。转基因及基因治疗转基因的基本方法劣势：

①容量小;

②只能感染分裂活跃细胞，体外(Exvivo)转基因;

③Transiteexpression;

④R.V.+P.C+P.C实验室要求高。转基因及基因治疗转基因的基本方法

2）腺病毒(Adenovirus)腺相关病毒(Adenoassociatedvirus)DNA病毒E1和E3基因缺乏263细胞系生长转基因及基因治疗转基因的基本方法特点：

①能感染静止细胞，体内(invivo)转基因

②对某些细胞类型特别亲和力，利于局部基因治疗

③包容量大

④尚无PackagingCell，欠安全

⑤有较强免疫原性，易引起体内免疫反应转基因及基因治疗转基因的基本方法2、非病毒法(Nonviral)

1）微注射法