医学微生物学的新挑战 2012

医学微生物学的新挑战湖南省第二人民医院尹铁球OUTLINE微生物学发展简史感染性疾病与人类自动化仪器的进展分子生物学在微生物检验中的应用细菌鉴定及分类耐药性检测病毒变异的临床意义微生物学发展简史

经验微生物学时期实验微生物学时期现代微生物学时期认识微生物的历程微生物的发现微生物学的开山鼻祖——列文虎克微生物学的奠基人——巴斯德医学微生物学的奠基人——科赫微生物学的经验时期

(十七世纪上半叶以前)利用微生物古希腊时蒸酒

微生物在地球上存在了30多亿年，人类并不知道一直和微生物生死共处我国公元2000多年前就利用微生物酿酒许多疾病是由微生物引起的：11世纪肺痨我国17世纪初，吴有性医生在《瘟疫论》中认为传染病是“乃天地间别有一种异气所感”，并且指出“气即是物，物即是气”，肯定地预见有某种实体是传染病的病原体我国18世纪，描述鼠疫实验微生物学时期

(十七世纪下半叶至二十世纪初)

1、微生物的发现和微生物形态学时期荷兰人列文虎克(Leeuwenhoek)(1632-1723)是微生物学的先驱微生物学的开山鼻祖

——列文虎克荷兰人用自己制造的显微镜观察到了被他称为“小动物”的微生物世界发现了杆菌、球菌和螺形菌实实在在看到并记录了一类从前没有人看到过的微小生命因为这个伟大的发现，他当上了英国皇家学会的会员

列文虎克观察到的微生物2、微生物生理学时期

建立了一套独特的研究方法,寻找各种传染病病原菌巴斯德在观察受狂犬病感染的兔脊髓巴斯德在工作中著名的巴斯德研究院巴斯德在微生物学上的贡献有机物发酵和腐败由微生物引起解决葡萄酒和啤酒变酸问题——创立巴氏消毒法解决蚕茧的“微粒子病”的疾病，挽救了法国蚕丝业主张传染病是由微生物引起的，并可通过接触、唾液及粪便传播19世纪70年代，研究炭疽病，拯救了畜牧业1881年研制成功减毒活疫苗——开创人类战胜传染病的新世纪1885年，巴斯德第一次治好了被疯狗咬伤的9岁男孩梅斯特——奠定了免疫学基础微生物方法学和医学微生物学奠基人——科赫

科赫1882年发现引起结核病的病原——分离出结核杆菌创立了微生物学检查方法：固体培养技术、染色技术、实验动物感染发现炭疽杆菌、霍乱弧菌总结了著名的“科赫法则”---确立病原微生物1905年获得了诺贝尔医学和生理学奖分离细菌的固体培养基Koch氏确定病原体四要点在每一例患病的病人中，都应找到此种微生物该微生物能被分离，且能在纯培养基中生长培养出的微生物接种于易感动物，一定能导致动物产生该病在实验性发病动物中，一定能观察并重新获得此种微生物李斯特在石炭酸喷雾下进行手术李斯特无菌操作奠基人伊凡诺夫斯基病毒的发现者欧立希（Ehrlich）

1910年砷凡纳明抗梅毒药的发现者1929年青霉素发现者弗莱明1940年弗洛瑞提纯应用于临床弗莱明

研究微生物的生命活动Domagk发现黄胺药Griffith发现细菌转化现象新病原微生物的确定方面1974年从莱姆(Lyme)病患者分得疏螺旋体1976年在美国费城一次退伍军人会议期间发生肺炎流行,次年分离出军团菌1983年从慢性胃炎病人活检标本中分离出幽门螺杆菌现代微生物学时期二十世纪中叶至今1986年我国台湾省分离得肺炎衣原体

1983年首先在美国发现人类免疫缺陷病毒（HIV）

近期新发现的病毒有肾综合征出血热病毒、新疆出血热病毒、B组轮状病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒等1973年以来认识的病原体示例年份微生物疾病1973轮状病毒全球性婴儿腹泻的主要原因1976小隐孢子虫急性和慢性腹泻1977埃博拉病毒埃博拉出血热1977嗜肺性军团杆菌军团病1977Hantaan病毒伴有肾综合征的出血热1977空肠弯曲菌全球散布的肠病1980HTLV-IT细胞淋巴瘤白血病1981金葡萄菌产毒素株中毒性休克综合征1982大肠杆菌O157：H7出血性肠炎、溶血性尿毒症1982HTLV-II毛细胞白血病1982Burgdorferi螺旋体莱姆病1983HIV爱滋病1983幽门螺旋杆菌消化性溃疡病1988HEV肠道传播的非A、非B型肝炎1990Guanarito病毒委内瑞拉出血热1992霍乱弧菌O139与流行性霍乱有关的新株1992Hellem巴尔通氏体猫抓病，杆状血管瘤病1994Sabia病毒巴西出血热1995G型肝炎病毒（HGV）非肠道传播的非A、非B型肝炎1995人类疱疹病毒8型与爱滋病有关的Kaposi肉瘤1996TSE致病因子克罗伊茨非尔特-雅各布病的新变型1997禽流感病毒A（H5N1）流感汤飞凡发现沙眼衣原体

病原微生物的致病机制方面微生物基因组研究方面微生物检测技术方面防治病原微生物措施方面感染性疾病与人类人类已经宣布消灭的疾病：天花在某些地区已经得到控制的疾病：麻疹、脊髓灰质炎、白喉、百日咳、结核、鼠疫正在流行的疾病：伤寒、痢疾、病毒性肝炎、霍乱……感染性疾病与人类新发生的传染性疾病原有微生物的再发一、新发生的传染性疾病1、原已存在但未被认为是传染病例如，消化性溃疡,T细胞白血病2、可能早已存在但未知,技术进步发现或人畜接触机会增加例如，丙型肝炎,莱姆病3、过去确实不存在,由于微生物发生变异而产生例如，AIDS,O139,耐药菌株,禽流感,SARS新发生的传染性疾病的原因人类的不良行为——进入以前未进入的原始森林和地区采矿旅游开垦嗜食野生动物宠物热——性乱和吸毒气候都市化——人口迁移拥挤易感人群增加“贫民区”医源性感染和滥用抗生素战争贸易水土流失微生物的持续不断变异新近认识的致病微生物禽流感病毒、SARS、H1N1、产NDM-1细菌……产NDM-1细菌超级细菌?产NDM-1细菌产NDM-1细菌：全称“产Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶（NewDelhiMetallo-β-lactamase1,NDM-1）肠杆菌科细菌”，简称“产NDM-1细菌”，是一种对多种抗菌药物广泛耐药的细菌，主要为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌；特点：属于肠杆菌科细菌，致病力与普通肠杆菌科细菌没有差别；由于产生NDM-1导致广泛耐药，为“泛耐药菌”；主要导致医院感染；源于南亚地区，已在全球播散。细菌耐药概念多重耐药（multipledrugresistance,MRD）:指细菌同时对三种以上结构不同（作用机制不同）抗菌药物耐药，如头孢菌素、喹诺酮类、氨基糖苷类；泛耐药（pan-drugresistance,PDR）:细菌对本身敏感的所有药物耐药；超级细菌（superbug）:并非科学概念，一般指PDR与部分MDR，没有确切定义，以下细菌属于此列：MRSA/VRSA;VRE;MDR-PA,PDR-AB;ESBL(+)+AmpC(+)肠杆菌产碳青霉烯酶肠杆菌（包括产NDM-1细菌）细菌耐药的危害Cosgrove,etal.ClinicalInfectiousDiseases2006;42:S82–9结果耐药菌感染(33例)敏感菌感染（66例）RR(95%CI)P值病死率（%）159--住院时间（天）1171.73（1.14-2.65）0.01矫正住院时间（天）1171.23(0.81-1.87)0.34医疗费用（$）66590222311.710.04产与不产ESBL大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌感染的后果比较细菌耐药的危害项目耐药组对照组感染结局：%治愈33.345.4恶化9.1

4.0病死率%11.7

5.4抗生素使用种数

3.4/3

2.2/2抗生素药费合计(元)均数/中位数5485.8±7143.3/2820.51849.0±3278.9/802.5总费用合计（元）均数/中位数74511.7±121406.8/29052.519852.9±38268.4/7445.5住院时间（天）33.9±39.2/21.018.1±23.7/12.0感染治疗时间（天）22.1±21.1/15.011.9±12.5/9.0肖永红等，抗生素类药物滥用公共问题研究，2008为什么需要关注产NDM-1细菌泛耐药导致的治疗挑战；多种肠杆菌科细菌发现；快速从南亚地区传播到欧美国家；不仅在医院感染这种发现，同时社区感染这种发现。产NDM-1细菌的发现2008年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中发现对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌，该菌对所有β-内酰胺类抗菌药物耐药，对环丙沙星也不敏感，仅对多粘菌素E敏感；该患者有多年糖尿病和中风史，经常往返于印度和瑞典之间，此前4月曾因臀部脓肿在印度住院治疗，其后回到瑞典，因尿路感染再度入院；这株细菌携带一种新型金属β-内酰胺酶，研究人员根据患者感染地命名这种酶为NDM-1。南亚和英国流行情况/infectionPublishedonlineAugust11,2010DOI:10.1016/S1473-3099(10)70143-2产NDM-1细菌种类肠杆菌科埃希菌属大肠埃希菌枸橼酸菌属弗劳地枸橼酸菌、异型枸橼酸菌、无丙二酸枸橼酸菌克雷伯菌属肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌肠杆菌属阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、板崎肠杆菌、聚团肠杆菌摩根菌属摩根摩根菌泛菌属成团泛菌、弥散泛菌普罗威登菌属产碱普罗威登菌、斯氏普罗威登菌、鲁氏普罗威登菌沙雷菌属粘质沙雷菌、液化沙雷菌、深红沙雷菌、居泉沙雷菌变形杆菌属奇异变形杆菌、普通变形杆菌、产粘变形杆菌志贺菌属志贺、宋内、弗氏、鲍氏志贺菌沙门菌属伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、猪霍乱沙门菌、副伤寒沙门菌哈弗尼亚属蜂房哈弗尼亚菌耶尔森菌属鼠疫耶尔森菌，小肠结炎肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌传播方式医院内感染污染的医疗器械;污染的医疗用品;污染的手跨国传播跨国医疗旅游产NDM-1细菌感染临床特点产NDM-1细菌主要表现为多重耐药，致病力与敏感细菌没有差别；主要引起医院感染；有社区感染报道；感染危险因素：危重患者，入住ICU；长期住院患者；使用广谱抗菌药物，或长期应用抗菌药物；插管或侵袭性操作；免疫抑制；呼吸机应用;……产NDM-1细菌感染临床特点主要感染类型：泌尿道感染；伤口感染；医院肺炎；呼吸机相关肺炎；血流感染；导管相关感染；

感染表现没有特别之处。碳青霉烯治疗感染无效，提示该类细菌感染可能，需要及时进行检查。实验室诊断产NDM-1细菌感染临床表现与敏感菌没有差异，临床诊断困难；对碳青霉烯治疗无效的阴性菌感染需要考虑这类细菌感染可能；诊断主要依据实验室检查结果；实验室检查分为三步：

表型筛查-表型确认-基因确证产NDM-1细菌表型筛查美罗培南或亚胺培南纸片法（K-B法，10μg纸片）或最低抑菌浓度（MIC）测定法对肠杆菌科细菌进行初步筛查，达到以下标准，需进行表型确认。

K-B法：美罗培南或亚胺培南抑菌圈直径≤22mm。MIC测定法：美罗培南MIC≥2mg/L；或亚胺培南对大肠埃希菌、克雷伯菌属、沙门菌属和肠杆菌属MIC≥2mg/L。亚胺培南美罗培南亚胺培南美罗培南产NDM-1细菌表型确认双纸片协同试验:采用亚胺培南(10μg)、EDTA（1500μg）两种纸片进行K-B法，两纸片距离10-15mm，在含EDTA纸片方向处，亚胺培南抑菌圈扩大，即可判定产金属酶。产NDM-1细菌表型确认采用亚胺培南（美罗培南）/EDTA复合纸片进行K-B法药敏试验，复合纸片比单药纸片的抑菌圈直径增大值≥5mm；亚胺培南（美罗培南）/EDTA复合E试条协同试验测定MIC，单药与复合制剂的MIC比值≥8;即可判定产金属酶。产NDM-1细菌基因确证采用NDM-1的基因特异引物进行PCR扩增及产物测序。PCR测序各医院对阳性结果须加以复核，同时菌株送有条件参考实验室进一步检测确证。1.加强对产NDM-1细菌监测医院重视临床微生物检验，提高细菌耐药监测能力；临床参考细菌检验结果应用抗菌药物；定期公布各医院细菌耐药监测结果；定期回顾细菌耐药流行趋势，及时发现异常耐药现象，早期发现产NDM-1细菌加以控制。2.加强抗菌药物合理使用监管医疗机构应当有专门抗菌药物合理使用管理小组，开展教育、培训、监督、检查抗菌药物使用情况；严格执行相关管理规定，特别是抗菌药物分类管理规定。特殊使用抗菌药物[卫生部卫办医政发(2009)38号]第四代头孢菌素：头孢吡肟、头孢匹罗、头孢噻利等；碳青霉烯类抗菌药物：亚胺培南/西司他丁、美罗培南、帕尼培南/倍他米隆、比阿培南等；多肽类与其他抗菌药物：万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺等；抗真菌药物：卡泊芬净，米卡芬净，伊曲康唑（口服液、注射剂），伏立康唑（口服剂、注射剂），两性霉素B含脂制剂等。3.加强医院感染的预防与控制加强医务人员感染控制教育、培训，强化对NDM-1细菌等多重耐药菌感染的预防、控制的认识。在进行各种侵袭性操作中，严格执行无菌操作。严格执行《医务人员手卫生规范》：医疗机构必须提供充足的手卫生设施。医务人员在接触病人前后、进行侵入性操作前、接触病人使用的物品或处理其分泌物、排泄物后，必须洗手或用含醇类速干手消毒剂擦手。3.加强医院感染的预防与控制3.加强医院感染的预防与控制加强对重点部门尤其是ICU物体表面的清洁、消毒。消毒剂：含氯消毒剂、0.5%过氧乙酸、2%戊二醛、0.5%醋酸环己啶-乙醇等；表面消毒方法：选择不同消毒液擦拭或浸泡。3.加强医院感染的预防与控制隔离疑似或确诊产NDM-1细菌感染或定植者，预防耐药菌传播。采用接触隔离，将病人安置单独房间，接触患者时需要穿隔离衣、戴手套，相关医疗器械或物品如听诊器、血压计等专用，不能专用的物品，需用后严格消毒。隔离期间需要定期检测耐药菌情况。二、原有微生物的再发病毒性疾病狂犬病、登革热、黄热病寄生虫

疟疾、血吸虫病、神经囊尾幼病、棘阿米巴病、内脏利氏曼病、弓形虫病、贾第虫病、棘球幼病细菌性

A群链球菌、战壕热、鼠疫、白喉、结核、百日咳、沙门菌属、肺炎球菌、霍乱、多重耐药菌株的流行多重耐药菌株的流行葡萄球菌肠球菌肺炎链球菌肠杆菌科结核分支杆菌多重耐药的结核杆菌是指病人排出的TB至少已对INH和RFP产生耐药或对5种基本抗痨药物（INH、RFP、链霉素、乙胺丁醇、砒嗪酰胺）中的两种以上（包括两种）耐药者发生原因：单一化疗、不合理化疗、不规律化疗对策：合理化疗，预防MTB出现加强检测，及时检出MTB约有75%的临床分离株存在RNA聚合酶β亚单位基因(rpoB)发生突变，对RFP耐药肠杆菌科对三代头孢菌素耐药的肠杆菌科在临床大量出现主要耐药机制:产生超广谱β-内酰胺酶(Extend-spectrumβ-Lactamases,ESBLs)持续产Ⅰ型β-内酰胺酶肠球菌可引起多种临床感染对头孢菌素、林可霉素、磺胺类呈现天然耐药,对氨基糖甙类部分天然耐药现已出现耐万古霉素的肠球菌(VRE)耐万古霉素的肠球菌(VRE)由VanA,VanB和VanC控制VanA对万古霉素和替考拉宁高度耐药VanB对万古霉素高度耐药,对替考拉宁敏感VanC对万古霉素和替考拉宁高度耐药选用氯霉素红霉素四环素及利福平或其它药物葡萄球菌对甲氧西林耐药的葡萄球菌对万古霉素中度敏感的葡萄球菌对万古霉素耐药的葡萄球菌对甲氧西林耐药的葡萄球菌由mecA基因编码的PBP2a与现有的β-内酰胺类抗生素亲和力极低常伴有大内环酯类、林可霉素类和其它抗生素的多重耐药常呈异质性表达万古霉素是唯一有确切疗效的药物凝固酶阳性和阴性的葡萄球菌均有较高的发生率MRSA的调控机制调控基因mecI,mecRIMecI为阻遏基因，其编码产物为mecI蛋白，为mecA基因的抑制子（repressor)MecRI为诱导剂激活基因，在诱导剂存在时编码mecRI蛋白，是一种辅助诱导因子（co-inducer),解除对mecI蛋白对mecA基因的抑制对万古霉素中度敏感的

葡萄球菌（VISAorGISA)对万古霉素的MIC在8-16ug/ml已有数起报道、主要发生在MRS中测定困难：异源性表达、生长缓慢、常规方法不能识别（K-B法、MicroScanrapidplate)Vitek

旧版软件不能测定（只能测到4ug/ml万古霉素），新版能测定三、自动化技术在微生物学

检验中的应用数码及数值鉴定技术常见的鉴定系统常见的鉴定系统VITEKAMS系统ＭicroScan系统BDBDPhoenixSystemBBL™Crystal™半自动细菌鉴定系统

BBL™Crystal™AutoReader自动细菌鉴定系统

使用自动化鉴定仪的局限性所有实验室工作人员必须认识仪器的局限性。细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深而不断演变，及时补充和修改数据库是自动化鉴定仪生存的根本要加强对自动化仪器的日常维护和质控自动化鉴定仪得出的结果，必须要与其它已获得的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。四、分子生物学在微生物检验应用核酸杂交(生物芯片）核酸扩增技术①靶扩增系统，包括PCR、TMA、SDA；②探针扩增系统，包括Qbeta复制酶、LCR；③标记扩增技术。④多重PCR，RT-PCR，nest-PCR，RAPD,PCR-SSCP等技术-细菌鉴定及分类分子生物学-耐药性检测耐药基因的检测糖肽类：vanA，vanB，vanB2,vanC1，vanC3，vanD。β-内酰胺类：mecA，blaTEM，blaROB-1，blaSHV，blaIMP，blaMIR-1，blaOXA，blaPER-1，blaPER-2，blaOXY-1，blaOXA-10/11喹诺酮类：gyrA，gyrB，parE

乙胺丁醇：embB，吡嗪酰胺pncA。利福平rpoB。链霉素：rpsL，rrs。异烟肼：katG，inhA，ahpC应用基因技术进行分型和鉴定菌种鉴定菌株分型研究其亲缘关系：复发和再感染判断分析不同种属间的差别揭示种内不同菌株间的细微差异弥补了表型分型的不足多用于分子流行病学研究这些技术包括：RAPDRFLPAFLPSSCPPFGEDNASequence细菌种属的鉴定DNA碱基组成的测定DNA-DNA杂交16SrRNA同源性分析

细菌种属特异基因细菌毒力基因DNA碱基组成的测定细菌间DNA分子同源程度可以用细菌DNA分子的G+C或A+T摩尔百分比来反映。亲源关系越近的细菌，G+Cmol%越相近G+Cmol%含量不同的细菌，为不同种细菌含量相同的可能为不同种的细菌不同菌属间G+Cmol%范围在25%-75%之间。细菌的G+Cmol%相当稳定，不受培养条件、菌龄和其他外界因素影响。最常用的方法是热变性法，其次是高效液相色谱法和浮力密度法DNA-DNA杂交DNA杂交可得出DNA之间核苷酸顺序的互补程度，从而推断不同细菌基因组间的同源性。目前最常用的是复性速率法同一菌的复性率为100%80%-90%的同源为同一种内同一亚种的细菌60%-70%同源性为同一种内不同亚种的细菌20%-60%同源则是同一属中的不同菌种这种方法还可对新菌种或表型性状差别很小而难以肯定的菌株做出较可靠的判定，并可修正其他方法的分类和鉴定错误16SrRNA同源性分析rRNA-DNA杂交变性rRNA与变性DNA混合时，rRNA与其互补的DNA链形成杂交双链，rRNA分子与异源DNA杂交时，也能在其同源区形成互补双链，这种杂交双链的稳定性与其同源性成正相关，适于细菌属及属上水平的分类研究。现最常用的是硝酸纤维膜结合法16SrRNA序列测定rRNA分子具有高度保守性，在所有的细胞生物中都存在，在长期的进化中，16SrRNA的总碱基数有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互对齐进行比较16S-23SrRNA序列测定

在16S和23SrRNA的间隔区，各菌种的长度是不一样的，利用包含16S和23SrRNA部分序列的引物对间隔区进行扩增，分析其长度多态，或结合RFLP技术进行分析来鉴定菌种此外限制性内切酶长度多态性分析（RFLP）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、随机引物扩增法（RAPD）等技术常用于菌株间的差异比较

细菌种属特异基因某些基因为细菌种特有或属共有，通过对这些基因的检测可以鉴定细菌的种或属如编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的inv基因：invA、invB、invC、invD、invE等是一组只存在于致病性沙门菌中的独特的保守基因序列。鞭毛蛋白dlh基因通常只存在于伤寒沙门菌IS6110、IS986插入片段为结核分枝杆菌复合群所拥有等细菌毒力基因某些以毒素致病的细菌含有特定的毒力基因霍乱弧菌的霍乱毒素基因产肠毒素大肠埃希菌的耐热（ST）和不耐热肠毒素（LT）白喉棒状杆菌的外毒素基因可以应用以上技术测定毒力基因的存在，以示相应的细菌存在五、病毒变异的临床意义病毒突变体的起源某些病毒的基因突变率可高达10-3～10-4（例如逆转录病毒HIV），而有些病毒突变率仅为10-8～10-11（如疱疹病毒），相当于细胞DNA的自发突变率。大多数RNA病毒的突变率要远远高于DNA病毒诱发突变突变具有双重作用，病毒突变可使其抗原性发生改变,从而逃逸免疫应答，但大多数突变是有害的，并会产生许多缺陷颗粒人工突变现代分子生物学技术可以对病毒基因组进行突变，如直接诱发寡核苷酸突变和基于PCR的基因突变技术已得到广泛应用。现在结合酶消化技术（引起基因缺失）和接头扫描技术（形成基因插入），可以在病毒基因组的任何特异性位点，准确安全地诱导出几乎任何类型的突变。这类突变可成为人工突变。病毒突变的类型生化标志物基因突变：耐药基因突变，导致病毒毒力改变的特异突变；形成多态性，使蛋白质和核酸电泳迁移率发生改变以及对灭活剂的敏感性改变。缺失突变：