人类疾病动物模型2

人类疾病动物模型

的制作王芳wangf@动物模型的制作1.查找文献并咨询动物实验所需动物和条件是否可行，了解前人所积累的经验，避免低水平的重复或缺乏科学依据的盲动所造成人力物力的浪费；2.从动物品种品系、年龄、性别、体重、生物学特点、动物微生物污染级别等方面选取最可比拟的动物，不可认为选越高级动物可比性越高。基本病理过程动物模型复制方法水和电解质紊乱：给家兔耳缘静脉注射5%氯化钾1ml/kg，剂量依次递增。描记心电图，测量血钾浓度。酸碱平衡紊乱：复制急性呼吸性酸中毒模型（用止血钳夹闭气管插管的2/3，持续10分钟，测动脉血气指标。）复制急性代谢性酸中毒模型（耳缘静脉注射5%的乳酸1ml/mim）复制代谢性碱中毒模型（耳缘静脉注射5%的碳酸氢钠10ml/kg）发热：大肠杆菌内毒素法、大肠杆菌法、伤寒杆菌内毒素法弥漫性血管内凝血：用幼犬或家兔，静脉注射10%高分子右旋糖酐(40万-50万U)15ml/kg在3分钟内注入、纤维蛋白原90mg/kg。给药后的20分钟、40分钟、60分钟分别采血查Hb、RBC、BPC、PT、TT、KPTT和纤维蛋白原。休克：失血性休克（家兔、放血法）感染性休克（大鼠、尾静脉注射内毒素）肿瘤疾病模型的复制根据建立的方法不同

自发性肿瘤模型诱发性肿瘤模型移植性肿瘤模型（1）自发性肿瘤模型是指利用实验动物本身某种自发肿瘤发病率高所建立的动物模型，如利用AKR小鼠建立白血病模型、利用C3H小鼠建立乳腺癌模型。优点：自发性肿瘤通常比用实验方法诱发的肿瘤与人类所患的肿瘤更为相似，有利于将试验结果推用到人；这一类肿瘤发生的条件比较自然，有可能通过细致观察和统计分析而发现原来没有发现的环境致癌因子。缺点：肿瘤的发生率参差不齐，不可能在短时间内获得大量的肿瘤学材料，观察时间长，实验消耗大。

某个近交系动物在一定年龄内，可以发生一定比率的某种自发性肿瘤。目前已培育了许多种小鼠自发肿瘤，从肿瘤发生学上看，这些自发瘤与人体肿瘤相似。AKR小鼠－－→白血病，出生后1.5年90%的发病率C3H小鼠－－→乳癌，繁殖雌鼠100%发病率A系小鼠－－→肺癌，18个月内90%发病率（2）诱发性肿瘤模型是指对实验动物给予致癌物质、射线以及某些致病病毒而诱发各种肿瘤的动物模型。如利用二乙基亚硝胺诱发小鼠肺癌；利用甲基胆葸诱发小鼠胃癌和宫颈癌；感染小鼠白血病病毒可诱发白血病等等。（2）诱发性肿瘤模型：1.方法：原位诱发：指将致癌物直接与动物靶组织或靶器官接触而诱发该组织或器官发生肿瘤，接触方法可通过涂抹、灌注、喂养或埋置等。异位诱发：将与致癌物接触后的动物组织或器官埋置于该动物或另一正常动物皮下而产生的该组织或器官的肿瘤。异位诱发肿瘤具有易于观察和取材的优点。2.诱癌物：放射线局部照射、化学致癌物（烷化剂、亚硝胺类、芳香胺类）、生物毒素（黄曲酶毒素）、细菌（幽门螺杆菌）、肿瘤病毒感染。举例：1.二乙基亚硝胺(DEN)诱发小鼠肺癌：采用小鼠皮下注射1％DEN水溶液，每周一次，(每次剂量为56mg/kg体重，总剂量为868mg)。观察时间为100d左右。此模型诱发率约40%。若将DEN总剂量增到1176mg时，半年诱发率可达90％以上。

亚硝胺类致癌物特点：①致癌性强，小剂量一次性可致癌；②对多种动物的多个器官能致癌，甚至可通过胎盘致癌；③具有不同结构的亚硝胺有明显的器官亲和性，如：二甲基亚硝胺等对称的衍生物常引起肝癌；不对称的亚硝胺诱发食管癌.2.亚胺基偶氮甲苯(OAAT)诱发小鼠肝癌：用l％OAAT苯溶液涂于动物两肩胛间皮肤上，隔日1次，每次2—3滴、一般涂100次。7个月以上诱发肝肿瘤约55％。

芳香胺及偶氮染料类致癌特点：①需要长期大量给药才能致癌；②肿瘤发生于远离作用部位（肝、膀胱等）；③明显的种属差异；④其本身不是致癌物，致癌是由于某种代谢产物的作用；⑤其致癌作用受营养及激素的影响，如：邻位氨基偶氮甲苯引起雌性大鼠的肝癌。3.黄曲霉素诱发大鼠肝癌：在大鼠饲料中加入黄曲霉素，含0.011-0.015ppm，喂养6个月，诱发率达80％。

黄曲霉素的毒性很强，很小剂（1mg/Kg）可致动物死亡，致癌性很强，是化学致癌物中最强的；它能诱发多种动物从鱼到猴的肝癌。滴入气管内可引起肺磷状细胞癌。注意事项：1.必须适当选择：致瘤方法、动物种系、致癌物种类与溶剂、给药剂量与途径及观察时间等尽量简便可行，有较好的重复性，并有利于与人肿瘤比较。2.方法和种系应对所用致瘤物敏感。3.致癌物的剂量应能保证动物存活率较高、诱发期较短而又可诱发较高频率的肿瘤。

（3）移植性肿瘤模型是将肿瘤细胞接种于相关种属的实验动物所建立的动物模型。常以裸鼠为移植受体。一般最常用的就是皮下移植和原位移植。肿瘤组织块移植法腹水瘤细胞移植法肿瘤细胞培养液移植法肿瘤组织悬液移植法肿瘤组织移入动物体内的方法肿瘤组织块移植法：

肿瘤细胞皮下接种——7-10d处死荷瘤动物——选择生长良好、无坏死液化的瘤组织——2-3mm3+生理盐水或其它营养液——无菌套管针抽吸——接种同种受体动物右前腋窝皮下。整个过程尽量在肿瘤切除后1小时内完成。肿瘤组织悬液移植方法：选取生长良好、有光泽、淡红色的瘤组织块，剪成1mm2的小块，在加有PBS的玻璃培养皿中剪碎，再在玻璃匀浆器内研磨制成悬液后，经80-100目网筛过滤成单细胞悬液。移植：按每只0.2ml,细胞数为1×106个。本法适于成活率高的移植瘤的常规接种和大批量的动物接种，优点是一次可以移植大批动物，所用瘤细胞数可定量，缺点是不易按需要定位。肿瘤细胞培养液移植方法：

一般采用先分离培养原代瘤组织，再做瘤细胞培养。包括仪器准备、物品清洗准备、无菌操作环境准备、取材与消化分离、细胞悬液培养、肿瘤细胞培养液的制备、肿瘤细胞培养液移植。移植：对肿瘤细胞培养液经台盼兰染色和计数，当活细胞比率大于90%，细胞浓度1×106个/ml时，即可按每只裸鼠0.2ml接种于皮下或其他所需部位。腹水瘤细胞移植：

肿瘤细胞皮下接种——7-10d处死荷瘤动物——取腹水——含葡萄糖平衡盐水稀释至适当浓度——腹腔注射（腹水瘤）或皮下注射（实体瘤）。

使用杂交瘤细胞制备单克隆抗体的过程中，杂交瘤细胞在BALB/c小鼠体内传代是典型的腹水瘤细胞移植方式。评价:1.同时接种同样量的瘤细胞，生长速度较一致，个体差异较小。2.接种成活率近100%。3.对宿主影响相类似。4.可连续传代，试验周期短，条件易于控制。5.主要问题是宿主对移植物产生免疫排斥反应。移植途径皮下移植原位移植肾包膜下移植肌肉移植腹腔移植皮下移植：

就是将肿瘤细胞种植到皮下。皮下移植模型移植的优点就是成功率高，操作非常方便，对动物本身影响也小，皮下瘤生长相对较慢，所以干预时间长些。一般常用在抗肿瘤药物的筛选上。皮下移植使用肿瘤组织块、组织悬液或细胞培养液均可。一般选择右侧腋下、背部、腹股沟等部位皮下移植。人膀胱EJ细胞皮下移植原位移植：

即将肿瘤细胞移植于肿瘤原发部位相同的动物脏器内，如将人肝癌细胞移植于裸鼠的肝脏，人胃癌细胞移植于裸鼠的胃。原位移植模型的优点就是更接近肿瘤发生发展的实际情况，实验说服力强，缺点就是操作复杂。高分辨率小动物超声影像系统

Vevo770High-ResolutionImagingSystemHUAWANG,MAKOTOSATOH,HISASHIABE，etal.UROLOGY68(3),2006动物活体成像系统VivoBioluminescenceImagingSystemYANLI.TUMOR2009,29(1).肾包膜下移植：肾包膜下移植一般选用肿瘤组织块移植，因为肿瘤组织块可固定于一定位置，而用组织悬液或细胞培养液移植，瘤细胞易于溢出包膜外，并呈广泛弥散。

还有肌肉、腹腔移植等。移植瘤模型成功的影响因素肿瘤组织恶性程度：恶性和转移的复发瘤成功率较高；种类：细胞系的成活率大于活检标本；来源：淋巴瘤、骨肿瘤成功率低；部位：肿瘤块的外周部接种易成活。裸鼠

遗传背景：胰腺癌接种BALB/c成功，NIH失败；性别：雌激素依赖性肿瘤接种雄鼠生长慢；鼠龄：4-6周；动物健康状态。接种部位

原位移植成功率高，移植肿瘤与人类原发瘤相似。有些肿瘤需要接种在特定的部位，如对雌激素依赖的乳腺癌MCF-7细胞系，需接种乳腺脂肪垫才能成活。其他环境：细菌病毒可以影响NK细胞活性；接种时间：越早越好;无菌操作。胃癌移植瘤模型注意：选用皮下移植还是选用原位移植，关键取决于你的实验目的，具体的实验方法和手段都是为你的研究目的而服务的。如果你只是观察某种药物对某种胃癌细胞的体内作用，做皮下瘤就行，当然做原位移植更好；如果你要研究胃癌细胞的侵袭或转移，就要做原位移植了。方法：1）术前准备：眼科剪2把，眼科镊2把，培养皿2个，1ml注射器1套，小鼠固定板，眼科小圆针2根，8/0丝线、3/0丝线若干消毒备用。无菌手术衣、手套、口罩、帽子；麻醉剂、甲醛固定液、生理盐水、RPMI-1640培养液、超净工作台或层流柜。术前1小时紫外照射30分钟。2）移植方法：取6-8周健康裸鼠，术前禁食12小时，以0.5%的戊巴比妥钠麻醉，消毒，选择左侧正中旁切口，打开腹腔后将胃拉出，用眼科剪细心剪破腺胃胃壁浆膜，将瘤组织块埋入浆膜下，再以8/0丝线穿透全层将瘤组织缝挂在胃壁上，最后以4/0丝线分别缝合腹膜（含肌层）及皮肤。若以肿瘤细胞悬液或细胞培养液移植时，可用注射器刺入胃壁浆膜注射。注射后，应观察到明显隆起的小包。否则，可能是穿透胃壁，注入胃内。应重新再试。

3）术后观察：术后1周左右动物伤口愈合，皮肤缝线脱落。术后第3-4周左上腹可触及0.2cm-0.3cm的小结节，5-6周左上腹结节逐渐增大且质地变硬。8-10周左右可触及1.0cm-1.5cm的包块，左上腹包块透壁可见，表面呈结节状，动物逐渐消瘦。12周以后动物极度消瘦，活动受限，部分动物瘤体突出至皮下。16周以后动物拒食，逐渐衰竭而死亡。生存期约为16-24周。

高血压的研究

最常用的是犬和大鼠。犬与人类的高血压有很多相似之处：1.高血压早期波动较大，以后逐渐升高，并维持在高水平；2.环境和紧张刺激引起血压明显升高；3.高血压发展过程中出现高级神经活动障碍；4.部分动物血中儿茶酚胺含量增加。

若研究高血压病理、生理和药理，SHR（自发性高血压大鼠）是良好的模型，1.遗传因素占主要地位；2.高血压早期无明显器质性改变；3.病程相似，血压升高随年龄增加而加剧；4.紧张刺激和大量食盐等环境刺激加重高血压的发展，5.血压上升早期或高血压前期有高血流动力学的特征；6.发生继发性心血管损害，出现心脑肾合并症。

实验性高血压动物模型

复制实验性高血压模型常选用犬、猫、家兔和猴等，复制方法很多，如通过神经反射、外源性儿茶酚胺类或其他体液加压物质的注射直接刺激中枢神经系统等。1．听源性高血压

采用大白鼠与家鼠杂交生的大灰鼠（比纯种大白鼠较易诱发成功），4月龄，放入隔音室内笼养，噪音刺激可由电铃或扬声器发出，发音器是一个音频振荡器，连接一个20W高音扬声器。噪音刺激应经常在700～1000周/秒中变换，噪音刺激每30秒一次，亦可每隔1分钟刺激30秒。可随时变换毋须恒定，但噪音干扰须日夜不止，连续数月。噪音刺激连续3个月后血压普遍升高，大灰鼠正常平均收缩压为113±8mmHg，此时可升高到130～140mmHg，有40%动物收缩压可高达160mmHg。此种高血压动物模型与人的高血压病相类似，适用于降药物的筛选。

2.缩窄肾动脉法。缩窄肾动物致高血压是十分经典的动物模型。肾动脉缩窄可造成肾脏缺血，导致肾脏内肾素形成，血管紧张素含量增加，使血压升高，晚期高血压维持因素也包括神经血管机制。下面以犬和家兔为例，介绍动脉缩窄性高血压动物模型的复制方法。

将犬和家兔麻醉后，腹向下固定，腹下垫一长枕使腰部顶起，从脊柱旁1.5-2㎝处开始，右侧顺肋骨缘，左侧在离肋骨缘约两指宽的地方作4㎝长的皮肤切口。切开皮下组织和腰背筋膜，并在内外斜肌筋膜连接处旁边，切开内斜肌筋膜，推开背长肌，暴露盖在肾周围空隙上的腹横机肌腱。顺肌纤维切开肌肉，并将肌肉分离开。用手指通过手术区摸到肾脏，并在肾切迹与主动脉之间找到强力搏动着的肾动脉。按所需长度，小心地钝性分离出一段肾动脉。选用一定直径的银夹或银环套在肾动脉上，或者用缝线将相应直径的铁圈绑扎在血管上面，将缝线结扎紧后取下铁圈。如果是单侧肾动脉缩窄，则应将另一侧肾切除。后一手术在间隔10-12天进行。一般肾切除手术后几天，血压开始升高，1-3月后达到高峰。并可长期维持下去。3．肾外包扎性高血压

肾外异物包扎，可致肾周围炎，在肾外形成一层纤维素性鞘膜，压迫肾实质，造成肾组织缺血，使肾素形成增加，血压上升。

选用120～150g大白鼠，麻醉后，皮肤消毒，从第10胸椎到第3腰椎处沿脊椎中线切开皮肤，在左侧季助下1.5～2cm和距脊椎1cm处用小血管钳分开肌肉，用两脂从腹下部将肾脏自创口中挤出，小心地将肾脏与周围组织剥离，将自制的双层乳胶薄膜剪成“X”形，绕肾门将肾脏交叉包扎，然后在相对侧切开，取出右肾，分离后切除，分别缝合肌肉和皮肤创口。皮下注射1～2万单位青霉素G。术后可加饮1%氯化钠溶液作为促进因素，约经20天，有70%以上的大白鼠出现高血压。收缩压一般可升高50%以上。模型概述

糖尿病动物模型复制方法主要包括6种：自发性模型:KK糖尿病小鼠；BBwistar

大鼠；NIH肥胖大鼠品系（SHR/N-cp）；中国地鼠（黑线仓鼠）。2.注射致高血糖因子，如生长激素、胰高糖素、糖皮质激素以及儿茶酚胺类激素等，复制出某些继发性糖尿病模型。糖尿病动物模型3.注射化学物质引起胰岛β细胞的损伤，如链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)、四氧嘧啶、二苯硫代卡肥腙可造成胰岛β细胞不可逆损伤；环丙庚哌、天门冬素酶、6—氨基尼克酰胺(Nicotinamide)、2—脱氧葡萄糖、甘露庚酮糖可引起β细胞可逆性损伤。4.

注射生物及生物制品引起β细胞破坏，如鼠脑炎、心肌炎病毒M型变异可诱发若干品系的成年小鼠糖尿病，IL—1在一定剂量和范围内对β细胞有选择性细胞毒作用，导致IDDM。5.

手术切除胰腺的大部分或全部，并给予高糖饮食刺激，引起继发性永久性糖尿病。6.

筛选、引种、繁殖遗传性及自发性糖尿病，这类动物模型更接近人类糖尿病的自然起病及发展，尤其适于研究糖尿病的病因学。一、病毒诱发法

DBA/2雌性小鼠，皮下接种脑炎、心肌炎病毒M型变异株4—7天后出现明显的高血糖，伴有血中及胰腺中胰岛素含量降低。

评价：

其高血糖为特发性，伴明显低胰岛素血症，在某些小鼠中可自然缓解，但糖耐量异常及高血糖在恢复期中仍将存在.造模方法二、四氧嘧啶法

SD大鼠200g左右，40mg/kg四氧嘧啶静脉注射1次，观察血糖>300mg/dL，持续2周可以认为造模成功。三、链脲佐菌致糖尿病Wistar大鼠

链脲佐菌素可造成动物胰岛β细胞大量坏死，通过不同给药方法，可复制出速发型类似NIDDM和迟发型类似IDDM的动物模型。1)速发型：

STZ用0.1mmol/L无菌枸橼酸—枸橼酸钠缓冲液新鲜配制成2％溶液，调节pH至4.5，滤菌器过滤除菌。大鼠禁食10h按50～65mg/kg腹腔内或尾静脉一次性注射，24h内随机血糖≥16.7mmol/L，稳定5d即可作为成功模型。2)迟发型：

链脲佐菌配制同前，福氏佐剂(CFA)按4:1称取液体石蜡和羊毛脂，研碎混匀，经高压消毒后低温保存，使用前按1.5mg/0.5ml加入无菌灭活卡介苗。第1天腹腔注射0.5mlCFA，次日按25mg/kg腹腔内注射STZ溶液。每周1次，连续3周，第2周部分大鼠就可成模型，第3周成模率87.5％。评价：1.速发型

一次足量给予链脲佐菌素，造成β细胞大量损伤，胰岛素合成和分泌减少，引起糖代谢紊乱，导致糖尿病。速发型模型较适于NIDDM的相关研究。通常单剂量达50mg/kg体重不出现自然缓解现象，第6～27天，胰岛有一定程度再生，功能部分恢复，但仍处于高血糖状态。2.迟发型

福氏完全佐剂可激发机体免疫功能，将小剂量STZ和CFA联合使用，可激活大鼠体内淋巴细胞诱导胰岛β细胞发生轻度改变，被激活的HLC可将轻度变性的细胞作靶细胞攻击，导致自身免疫，胰岛β细胞损害加重，引起糖尿病。迟发型模型有免疫学的改变，更接近人类IDDM的发生发展变化，有报道可测得大鼠体内抗胰岛细胞抗体。3.化学诱导是一种简便，价廉的方法。其中STZ优于四氧嘧啶，其造模稳定，快速，无自然缓解，种属选择性不强(豚鼠只能用链脲菌素造模)，复制前不需禁食。糖尿病形成后无需特意安排动物饲养条件。STZ可作用于对四氧嘧啶致糖尿作用有抵抗的豚鼠。但价格较四氧嘧啶贵。4.四氧嘧啶和链脲菌素均为一种可以选择性作用于胰岛β细胞的化学物质，其作用机制目前有不同认识，有人认为是破坏了细胞本身，有人则认为仅是细胞脱颗粒或是胞膜上葡萄糖受体的变化。四、高糖饲喂诱发法

选用SHR/NLH—CP大鼠5周龄，喂饲含54％庶糖饮食。1个月时，观察到OGTT异常，6.5个月时胰岛素反应异常，9个月时可见体重减轻，衰弱。

评价：

一些动物品系有自发或在施加诱导的条件下发生糖尿病的倾向。SHR/NLH-CP大鼠模型某些代谢和组织病理特征与人类非胰岛素依赖性糖尿病相似，该模型还可观察糖尿病肝肾损害。

1982年，Hegreberg与Leathers发表了一部两卷的动物模型目录，第1卷“自发性动物疾病模型”包括了1298篇文献，第2卷“诱发性动物疾病模型”包括了2707篇文献。国内施新猷主编“医学动物实验方法”（人民卫生出版社，1980年）、郭鹞编“人