诺如病毒 课件

诺如病毒(诺瓦克病毒)1．病原学诺瓦克病毒（NorwalkViruses，NV）是人类杯状病毒科(HumanCalicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）属的原型代表株。NV是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺瓦克病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原。此后，世界各地陆续自胃肠炎患者粪便中分离出多种形态与之相似但抗原性略异的病毒样颗粒，均以发现地点命名，如：HawaiiVirus（HV）、SnowMountainVirus（SMV）、MexicoVirus（MxV）SouthamptonVirus（SOV）等，先是称为小圆结构病毒（SmallRoundStructuralVirus,SRSV），后称为诺瓦克样病毒（Norwalk-likevirus,NLV）,直至2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒（Norovirus,NV）。诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒（Sapporo-likeVirus，SLV），现在的正式名称为札如病毒(Sapovirus,SV)，合称为人类杯状病毒。NV有许多共同特征：直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型；基因组为单股正链RNA；在氯化铯密度梯度中的浮力密度为1.36～1.41g/cm3；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。NV基因组是单股正链RNA，全长约7642nt，包括3个开放阅读框（OpenReadingFrames，ORFs）。ORF1编码包括保守的具有RNA多聚酶在内的非结构蛋白；ORF2编码分子量约为56Kda的衣壳蛋白；ORF3编码一种分子量约为22.5Kda的强碱性微小结构蛋白。Pamela等人研究发现ORF3表达的部分区域蛋白与衣壳蛋白发生交互作用，共同形成衣壳。NV成员庞杂，目前已对其100多个分离株进行基因测序。核酸的同源性分析表明，世界不同地区、不同时间流行的NV基因RNA多聚酶区序列相对保守，核苷酸氨基酸序列同源性高于60%，有的达到90%以上。因此，根据RNA多聚酶区核苷酸序列的相似性，将NLV分为5个基因组,其中感染人的包括基因组Ⅰ、Ⅱ和IV：基因组Ⅰ，以Norwalkvirus（NV）为代表，包括Southampton（SOV）、DesertShieldvirus（DSV）等；基因组Ⅱ，以SnowMountainvirus（SMV）代表，包括HawaiiVirus（HV）、MexicoVirus（MxV）、Lordsdalevirus（LV）等；最近在动物体中发现了感染猪和奶牛的基因组属于基因组III和V。NV对热、乙醚和酸稳定，室温pH2.7环境下存活3h，20%乙醚4℃处理存活18h，60℃孵育30min仍有感染性，也耐受普通饮水中3.75～6.25ppm的Cl-浓度(游离氯0.5～1.0ppm)，但在处理污水的10ppm的Cl-浓度中被灭活。2．流行病学特征NV腹泻流行地区极为广泛，20世纪70、80年代世界上发生的非细菌性腹泻暴发中19%～42%系NV所致。在美国流行更加严重，1976～1981年美国成人非细菌性急性胃肠炎暴发流行中有42%是由NV引起的，1996年1月～1997年6月美国疾病预防控制中心收到的90起非细菌性胃肠炎暴发中，96%是NV引发。荷兰、英国、日本、澳大利亚等国家也都得到类似结果。1995年我国报道第1例NV感染起，陆续对山西、北京、安徽、福州、武汉、广州等地区NV感染暴发进行调查，结果证明NV感染在我国是普遍存在的。NV感染全年均有流行，感染对象主要是成人和学龄儿童，主要分布在学校、家庭、医院、军队、幼儿园、旅游区等，多在集体机构以暴发形式出现，1996～2000年美国疾病预防控制中心接报348起暴发，136起发生在饭店，101起在疗养院或医院，42起在学校和托幼机构，69起在度假场所和游船上。粪－口途径是主要传播方式，也可以通过污染的水源、食物、物品、空气等传播。由于病人的呕吐物和粪便可形成气溶胶，与病人接触可传染。隐性感染者及健康携带者均可为传染源，病人的呕吐物和粪便在自然界中污染水或间接污染食品，很容易造成暴发。暴发期间空气和污染物也是不容忽视的传播媒介。暴发中涉及的食物广泛，以贝类、沙拉、三明治、蛋糕、冰霜、冰块、饮水和木莓等直接食用品为主，其中贝类很可能来自污染水域，NV可以在贝类生物体内累积，而且用消灭大肠杆菌的方法不能净化，木莓也因污水浇灌而遭污染。血清抗体调查表明，一般NV抗体在童年逐渐获得，发展中国家抗体阳性率高于发达国家同年龄组儿童，如在日本4个月～1岁的婴幼儿NLV抗体阳性率<10%，而科威特5～11个月的婴幼儿MexioVirus(MX)和NV抗体阳性率分别高达79%和90%。我国7～11个月的婴幼儿MX和NV抗体阳性率分别为36.2%和41.4%，3岁以后2种抗体的阳性率均达80%以上。目前认为，NV抗体没有明显的保护作用，尤其是长期免疫作用。约半数患者病后可获短期对同株病毒的免疫，而不能对其它毒株产生交叉保护作用，所以极易出现反复感染。3．临床特征感染后潜伏期多在24～48h，少数在18～72h。发病突然，主要症状为恶心、呕吐、腹痛和腹泻。儿童患者呕吐普遍，成人患者腹泻为多，24h内腹泻4～8次，粪便为稀水便或水样便，无粘液脓血，粪检白细胞阴性。原发感染患者的呕吐症状明显多于续发感染者，有些病人仅表现出呕吐症状，故在临床曾有冬季呕吐病诊断。此外，头痛、轻度发热、寒颤和肌肉痛也是常见症状，严重者出现脱水。4．临床诊断20年前，曾制定了NLV流行的临床和流行病学诊断标准：粪便细菌和寄生虫检测阴性；呕吐患者占病人半数以上；病程在12～60h；潜伏期在24～48h，近来又将潜伏期修改为12～36h，并补充发病急、恶心、呕吐、腹泻、胃痛和少数病人发热、发冷等临床现象。5实验室诊断5.1标本采集粪便标本应在发病首日采集，至多不能超过发病急性期(48～72h)，此时为稀、软便，病毒排出量最多。一次流行，至少采集10例患者粪便，每份标本量约1～5ml，成形便和肛拭子诊断意义很小。标本置4℃可存放2～3周，运送也要低温条件。病人呕吐物是粪便标本的最佳补充，有助于病原的诊断。该标本的采集、储存和运送条件同于粪便。从流行病学角度出发，在水、食物或其它外环境标本中检出NV意义重要。需注意检测技术要锁定在高度怀疑的传播媒介上，尽早采样并置4℃存放，若是饮用水，需用大容量(5～100L)浓集病毒后检测。5.2实验室检查5.2.1电镜法直接电镜法(EM)和免疫电镜法(IEM)，EM法观察的灵敏度较低，要求每毫升粪便样品中至少有大约106个病毒粒子，因此只能用于患病早期病毒大量排出时采集的样本检测。IEM法比EM法的敏感性可提高100倍，主要应用患者恢复期血清捕捉同型抗原，从而增加检出率。电镜法的缺陷在于设备昂贵，不能广泛普及；检测结果与操作者的技能和经验有直接关系；灵敏度相对较低；不适于大规模流行病学调查。5.2.2免疫法包括放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-AvidinImmunoassy)和酶联免疫法(ELISA)。RIA法的灵敏度比IEM法可提高10～100倍，可以检测出抗体升高的水平，为流行病学提供更有参考价值的资料。RIA法的不足之处在于它需要6d，且需要放射性同位素标记。为了简化方法，美国疾病预防控制中心建立了生物素-亲和素免疫法，其灵敏度与RIA法相当，目前该方法已成为美国疾病预防控制中心检测NLV抗原和抗体的标准实验方法之一。1992年Jiang等重组杆状病毒表达NV衣壳蛋白成功后，建立起的NV酶联免疫检测方法快速、灵敏、经济，其不足之处是免疫反应的株型特异性太强，所以应用范围还比较窄。酶链免疫法特异性强，灵敏度高，诊断迅速，且较经济，是目前可广泛应用的检测方法。由于NLV培养还未成功，原来用作试剂的病毒抗原数量受到限制，现在，用分子生物学技术已经可以人工重组NV的衣壳蛋白，从而解决了上述问题。5.2.3分子生物学检测方法杂交技术和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)除了能更准确、灵敏地检测标本中的NV，尤其是低浓度的NV感染外，最大的优点在于可以进一步对病毒进行基因型的研究，不会受到获得分型单克隆抗体的限制，对流行病学研究具有重要意义。等温核酸扩增法(NASBA)直接扩增RNA来检测NV，样品中病原RNA得到指数级扩增，产物通过琼脂糖凝胶电泳或斑点印迹杂交鉴定结果。该方法的灵敏度略低于RT-PCR法；整个过程只有一步RNA扩增，避免了RT-PCR存在的RNA交叉污染；缩短了操作时间；假阳性率低。6.食物中NV的检测RT-PCR检测食物中NV存在样品病毒量含量低，样品量大且成分复杂等问题，因此病毒富集浓缩、样品处理是检测的关键，其中有两个重要方面影响检测结果，一是样品中病毒浓缩后的回收率，二是抽提核酸的完整程度和纯度。6.1病毒浓缩NV浓缩方法一般分为两大类，一类为有机絮凝沉淀法，主要使用聚乙二醇（PEG）沉淀，PEG是具有强烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物，先改变样品pH值，使毒粒与样品微粒分开，PEG把病毒沉淀下来，达到浓缩的目的。目前对于固体样品PEG沉淀法是最有效的浓缩方法。膜过滤法是另一类有效浓缩病毒的方法，通过改变膜的pH值使之与带有电荷的毒粒结合捕捉病毒，这种方法通常用在浓缩大体积的黏度小、内容颗粒小的液体食品或水中。检测海水、生活污水中的NV曾用过这种方法，为瓶装水和其他饮料浓缩NV提供了参考。6.2核酸提取食品样品成分复杂，所含有的脂肪、蛋白质、金属离子等物质都是RT-PCR反应抑制因子。NV是单链RNA病毒，核酸提取方法的优劣取决于两个方面：核酸的质量和去除抑制因子的能力。目前应用较成熟广泛的是胍法RNA提取法，即（异）硫氰酸胍-苯酚-氯仿联合裂解抽提法，该方法改进后制成市售的TRIzol、RNAzol、Ultraspec等产品，与石英砂、磁珠等多孔颗粒相结合，已结合了poly(dT)或特异探针的磁珠能较高程度的提纯mRNA，去除反应抑制因子。石英砂或磁珠纯化RNA与传统的有机试剂（异丙醇、乙醇）沉淀RNA相比起来，效果较好，只是成本偏高。7.NV腹泻治疗该病为自限性疾病，通常患者病程在48～72h，有的则更短。目前尚无特效的抗病毒药物，不需用抗菌素，预后良好。治疗主要是对症治疗或支持疗法。脱水是NLV腹泻致死的主要死因，故对严重病例，尤其是幼儿及体弱者应及时输液、纠正水、电解质、酸碱平衡失调，或口服世界卫生组织推荐的口服补液盐。8.预防控制措施8.1预防措施8.1.1健康教育加强以预防肠道传染病为重点的宣传教育，提倡喝开水，不吃生的半生的食物，尤其是禁止生食贝类等水产品，生吃瓜果要洗净，饭前便后要洗手、养成良好的卫生习惯。8.1.2免疫接种目前尚无理想的疫苗。8.1.3加强饮用水卫生要加快城乡自来水建设。在暂时达不到要求的地区，必须保护水源，改善饮用水条件，实行饮水消毒。8.1.4抓好饮食卫生严格执行《中华人民共和国食品卫生法》，特别要加强对饮食行业（包括餐厅、个体饮食店、学校周边饮食摊档等）、农贸集市、集体食堂等的卫生管理。食物加工者要严格注意个人卫生，一旦发病立即调离工作岗位。8.2病人、接触者及其直接接触环境的管理8.2.1隔离：对病人、疑似病人和带菌者要分别隔离治疗。8.2.2突发疫情报告：责任疫情报告人发现突发疫情后，城镇于6h内，农村于12h内以最快的通讯方式向发病地的疾病预防控制机构报告。8.2.3消毒：对病人、疑似病人和带菌者的吐泻物和污染过的物品、空气、饮用水、厕所等进行随时消毒，当染菌者送隔离病房或治愈后进行终末消毒。8.3流行期措