胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养

胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养

柴胡是一个非常重要的蔬菜品种。由于其高综合营养价值，它适合生吃、加工、称重等用途。近年来，随着生物技术和计算机科学的快速发展，作为生物技术研究的理想材料，许多国家对胡萝卜的防疫、遗传转化和再生技术、分子标记和基因克隆技术进行了广泛的研究。我国科学研究人员在胡萝卜生物化学和生物学技术的科学研究方面也取得了一些进展。特别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化和再生方面。然而，对于胡萝卜的细胞培养不足，因此需要继续研究。本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨,为其次生代谢产物α-胡萝卜素、β-胡萝卜素的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础.1材料和方法1.1来自来源胡萝卜种子由中国农科院蔬菜所提供.1.2方法1.2.1诱导、继代培养?(1)以胡萝卜子叶和下胚轴为外植体诱导.将胡萝卜种子搓去种毛,然后在75%的酒精中消毒5min,无菌水冲洗一遍后,用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍,再用无菌水浸泡30min,最后用无菌水漂洗一遍,接种在无激素的MS培养基上.10d左右种子开始萌发,待两片子叶伸展,而心叶刚刚显露时,将幼苗的下胚轴和子叶切成0.3cm左右的小段,接种在附加植物激素1.0mg/L2,4-D,1.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT,2.0mg/L2,4-D,2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT的MS培养基的三角瓶中,培养30天左右,即可诱导出愈伤组织.继代培养时,将老的和生长不良的愈伤组织去掉,将大的健康的愈伤组织切至0.5cm,再放于含0.1mg/L2,4-D的MS培养基(pH5.7)上继续培养.诱导和继代培养均在黑暗条件下进行,培养温度为25℃,继代培养时间为3周～4周更换一次培养基.观察并记录继代过程中愈伤组织状态的变化.(2)以胡萝卜直根形成层为外植体诱导.用清水洗净胡萝卜直根,用小刀削去表皮和顶部,将其在75%的酒精中消毒5min,再用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍,再用无菌水浸泡30min,最后用无菌水漂洗一遍.消毒好的胡萝卜直根,切去下边的2/3部分,留下部分用消毒好的小刀,沿截面横切成厚度1mm左右的小圆片,然后将小圆片的韧皮部和木质部切去,留下形成层,再切成长3mm,宽1.5mm,高1mm的小长块,接种在(1)中的诱导培养基上,获得愈伤后进行继代培养,培养环境条件与(1)相同.1.2.2细胞悬浮培养用镊子夹取在固体继代培养基上继代20d左右的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的愈伤,接种在含0.3mg/L2,4-D的液体培养基(pH5.7)中,每100mL的三角瓶中加入液体培养基50mL,摇床转速为110r/min,温度为25℃,黑暗培养.每隔7d继代一次,连续培养4代～5代后逐渐形成稳定的细胞系.细胞悬浮培养液体培养基成分与愈伤组织继代培养的培养基相同,但不加琼脂.每隔1d在倒置显微镜下观察细胞形态、分散程度并照相,进行细胞计数,以建立细胞数生长曲线.1.2.3计算波动曲线的测定取0.5g悬浮培养物,接入新鲜液体培养基中,进行振荡培养,每隔1d取样1次,共培养13d,连续做3次平行实验.1.2.4悬浮液总细胞数的测定用血球计数板法对胡萝卜悬浮细胞计数,全部操作在无菌环境下进行,每个结果为4次平行实验的平均值.细胞数按下面公式计算:1mL悬浮液中的总细胞数=A/5×25×104×B,A为5个中方格总细胞数,B为稀释倍数.2结果与讨论2.1外植体诱导获得愈伤组织有文献报道,不同外植体的脱分化能力不同,诱导出愈伤组织的频率和愈伤组织的状态也不同.在胡萝卜愈伤组织诱导时,本实验采用三种外植体:胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层.经过30d观察发现,三种外植体经过培养均诱导获得了愈伤组织.结果如下:以子叶为外植体的大约有2/3诱导获得了愈伤组织,多数愈伤组织呈浅黄色,生长旺盛,质地松散,含水量大,分散性好,但也有一些状态不好,色泽发暗,选取好的可作为细胞悬浮培养的材料;以下胚轴为外植体几乎所有都获得了愈伤组织,并且愈伤组织生长旺盛,呈黄色,比较疏松,分散性好,适宜于细胞悬浮培养;而以直根形成层为外植体获得的愈伤组织不多,色泽较暗,有些带褐色,愈伤组织生长缓慢,质地较硬,分散度差,不适宜于细胞悬浮培养.因此,可认为胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体.2.2织及继代培养验证不同的激素及激素浓度直接影响着愈伤组织的状态、质地和分散性,而这些因素又是松散愈伤组织的关键,也是进行细胞悬浮培养的必要前提.因此,本实验诱导胡萝卜愈伤组织及继代培养设计了4种激素组合[见1.2.1(1)],通过多次继代培养发现,1.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT组合诱导出的胚性愈伤组织(见图1)生长旺盛、呈黄色米粒状分散性好、质地松软、含水量小,有利于细胞悬浮培养,而半胚性愈伤不适合进行细胞悬浮培养.其他3种组合中,2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT诱导出的愈伤组织也比较疏松,而另两种诱导出的愈伤组织质地比较坚实,有褐化现象.可见,2,4-D与KT的结合有利于疏松愈伤组织的诱导.2.3细胞团和细胞数量的变化在细胞悬浮培养的过程中,需要不断地进行继代,来筛选出良好的、较稳定的细胞系.继代过程中,细胞悬浮液的颜色、细胞的形态、大小、数量不断在发生着变化.第1、2次继代时,细胞悬浮液为白色或浅黄色,混浊,有许多大颗粒,倒置显微镜下观察,细胞多数成团,保持较旺盛的分裂能力,单细胞大多呈长形、梭形、不规则形(见图2),细胞个体较大;3、4次继代时,细胞悬浮液变为黄色,比较粘稠,颗粒大小分布均匀,倒置显微镜下观察,分裂的细胞团增多,有的细胞团明显可见有20个～30个球形细胞组成,单细胞数目增多,而且大多呈球形;5次继代时,细胞悬浮液(见图3)呈透明的黄色,澄清,呈油状流动,颗粒分布很均匀,直径大多在0.5mm～1mm,倒置显微镜下观察,细胞团和单细胞很多,大多呈球形(见图4),大小均匀;6、7次继代以上时,悬浮液变得比较澄清,呈浅黄色,悬浮颗粒大小均匀,倒置显微镜下观察,细胞大多成团,可以清楚的看出细胞呈球形,比较均匀,也有单细胞,但是不多,这可能与细胞聚集成团的特性有关.因此,继代培养过程中,随着继代次数的增多,细胞悬浮液由无色或浅黄色变为黄色,由混浊变为澄清、透明,颗粒大小由不均匀到均匀,最终直径在0.5mm～1mm,倒置显微镜下观察,单细胞由长形、梭形、不规则形变为规则的球形,细胞系逐渐趋于稳定.随后,我们又从筛选出来的细胞系将细胞接种到不含激素的MS培养基上,7d后长出新的愈伤组织,30d后长出胡萝卜全苗并转入蛭石成活(图5),说明以细胞系转化为新的愈伤组织生成再生植株是成功的.2.4细胞起始密度的影响在细胞悬浮培养时,细胞生长需要一个最低生长密度,低于此密度,细胞生长速率降低或根本不生长.适宜的起始密度可以缩短细胞系筛选的时间,起始密度过大过小不仅会影响细胞系筛选的时间而且不利于稳定细胞系的建立.同时,细胞的起始密度对细胞培养周期也有影响.为此,本实验设计了4个密度梯度:0.4×104个/50mL,1.125×104个/50mL,2.325×104个/50mL,8.875×104个/50mL.培养13d,细胞状态随天数的变化见表1。从上表可以看出,一个好的悬浮细胞系,最初适宜的起始密度是关键的,它直接影响着细胞系的质量,也影响着一个培养周期内各个时期的时间长短.不同起始密度的细胞在进行细胞悬浮培养时,一个培养周期内各个时期的长短和到达对数生长期时间是有差别的.下面是不同起始密度的细胞培养13d对细胞培养周期的影响:细胞起始密度为0.4×104个/50mL时,细胞延迟期较长约3d～5d,可能是细胞首先需要聚集到一定密度,生长才比较明显.7d达到对数生长期,此时细胞数目增殖近18倍,但持续时间很短,只有一天,然后细胞数开始减少,11d时细胞衰退;细胞起始密度为1.125×104个/50mL～2.325×104个/50mL时,1d～3d为细胞延迟期,细胞增值比较缓慢,5d以后,细胞开始迅速增长,7d～9d达到对数生长期,此时细胞数目增殖近25倍,达到最高峰,9d～11d为细胞生长减慢期,在此期间,细胞数目增长缓慢;细胞起始密度为8.875×104个/50mL时,细胞延迟期较短只有1d～2d,7d达到对数生长期,但细胞数目增殖不到6倍,9d时,细胞增长缓慢,并很快衰退,可能是由于细胞密度过大,培养基营养耗尽.因此,由上面的分析,可以得出:进行胡萝卜细胞悬浮培养的最佳起始密度为1.125×104个/50mL～2.325×104个/50mL,它的生长曲线见图6,其培养周期为11d.3愈伤组织的鉴定(1)以胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层均可诱导出愈伤组织,其中以下胚轴诱导出的胚性愈伤组织最适合细胞悬浮培养.(2