酶工程-01-酶和酶工程概论

酶工程

EnzymeEngineering课程简介本课程讲授酶学和酶工程的相关知识，包括酶的生产、酶的改性以及酶的应用课程性质专业基础课，34+30=64学时，3学分适用对象：生物工程专业先修课程有机化学、生物化学、微生物学、发酵工程课程简介教材和教学参考书教材：《酶工程》（第三版），郭勇编著，科学出版社，2009课程简介教材和教学参考书教学参考书《酶工程》（第二版），罗贵民主编，化学工业出版社，2008《现代酶学》（第二版），袁勤生主编，华东理工大学出版社，2001《酶学原理与酶工程》，周晓云主编，中国轻工业出版社，2007课程简介课程主要内容酶和酶工程概论（第一章）酶的生产微生物发酵产酶（第二章）动植物细胞培养产酶（第三章）酶的提取与分离纯化（第四章）酶的改性酶分子修饰（第五章）酶、细胞、原生质体固定化（第六章）酶非水相催化（第七章）酶定向进化（第八章）酶的应用酶反应器（第九章）酶的应用（第十章）课程简介教学目的和要求以酶学的内容为基础，酶的工程应用为主，融入各章节内容中。通过本课程的学习，要求系统地掌握酶的生产、改性与应用的技术过程。理解和掌握酶工程的主要理论、概念，掌握酶工程的研究方法，熟悉工程应用。了解相关的新进展。考核方式期末笔试（闭卷）酶工程

EnzymeEngineering第一课酶和酶工程概论酶和酶工程概论酶（enzyme）定义：活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，又称为生物催化剂。分类：蛋白类酶（proteinenzyme，P酶）由蛋白质构成，部分含有金属及辅基，不含核酸成分核酸类酶（RNAenzyme，R酶）是具有催化能力的RNA分子内催化和分子间催化酶和酶工程概论酶工程（enzymeengineering）将酶或者微生物细胞、动植物细胞、细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术现代酶学理论与化工技术的交叉应用领域食品工业轻工业医药工业酶和酶工程概论本章主要内容酶的基本概念和发展历史酶催化作用特点影响酶催化作用的因素酶的分类与命名酶的活力测定酶的生产方法酶工程发展概况酶和酶工程概论酶的基本概念和发展历史远古时代——古老的“食品工业”中国夏禹时代：酿酒、酿醋——粬醪、醴、糵、麴(曲，粬)两周时代：饴糖、食酱、腌菜豆：两周时代的重要礼器和食器，盛放腌菜春秋战国时代：用麴治疗消化不良的疾病公元十世纪：制豆酱利用曲霉中的蛋白酶水解豆类蛋白得到酶和酶工程概论酶的基本概念和发展历史远古时代——古老的“食品工业”古埃及、古巴比伦时代：麦粉发酵酿造啤酒磨粉、去糠、打碎麦芽萌发、浸润成酒发酵、装瓶酶和酶工程概论酶的基本概念和发展历史近代——十八世纪始，酶学的萌芽和初步发展18世纪中后期，法国科学家Réaumur（雷默尔）buzzard（秃鹰）的胃液对肉块具有消化作用，这是一种化学变化而非物理变化过程（如溶解），而且这个化学变化是在很“温和”的条件下实现的1783年，Spallazani（斯帕拉扎尼）通过实验阐明了不仅鸟的胃液，其它动物和人的胃液也有类似的消化作用，这个作用还与温度、胃液加量有关，而且在体外是不稳定的，活性会逐渐丧失最早的酶学实验酶和酶工程概论酶的基本概念和发展历史近代——十八世纪始，酶学的萌芽和初步发展19世纪中叶，Pasteur认为酵母中存在一种使葡萄糖转化为酒精的物质，但他认为只有活的酵母细胞才能进行发酵1878年，Kühne“Enzyme”的诞生：En（在）+Zyme（酵母），表示酶在酵母中酶和酶工程概论酶的基本概念和发展历史近代——十八世纪始，酶学的萌芽和初步发展1894年，TakamineJoichi（高峰让吉）利用米霉菌固体培养法生产高峰淀粉酶（第一个商品酶制剂），其方法至今仍被采用。1896年（另一说1897年），Buchner（巴克纳）兄弟发现酵母粗提液也能将糖发酵成酒精表明起作用的非细胞本身，在细胞外也可以发生作用此项发现促进了酶的分离和对其理化性质的研究，也促进了生命过程中酶系统的研究。一般认为酶学研究始于此Buchner获得了1911年诺贝尔化学奖酶和酶工程概论酶的基本概念和发展历史近代——酶作用动力学说的提出1902年，Henri（亨利）——中间产物学说

底物转化成产物之前，必须先与酶形成复合物1913年，Michaelis（米彻利斯）和Menten（曼吞）——米氏方程

酶和酶工程概论酶的基本概念和发展历史近代——酶的本质和结构研究1926年，J.Sumner（萨姆纳）从刀豆中提取脲酶（urease），首次获得酶的结晶体1937年又获得过氧化氢酶结晶证实了酶是蛋白质获得1946年诺贝尔化学奖酶和酶工程概论酶的基本概念和发展历史现代酶学——快速发展时期核酸类酶（Ribozyme）的发现1982年，Cech（切克）发现四膜虫的26SrRNA前体在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，催化得成熟的rRNA。1983年，Atman和Pace等人发现核糖核酸酶P中的RNA组分M1RNA具有核糖核酸酶的催化活性，单独催化tRNA前体切除部分核苷酸而成为成熟的tRNAThomasCech酶和酶工程概论酶的基本概念和发展历史现代酶学——快速发展时期核酸类酶发现的重大意义RNA具有酶的催化活性，向酶的化学本质是蛋白质这一传统概念提出了挑战在理论上，对于生物起源和生命进化的研究具有重要启示。核酸类酶具有内切酶活性，可定点切割mRNA，破坏mRNA，抑制基因表达，为基因、病毒和肿瘤治疗提供了可行途径。酶和酶工程概论第二节酶催化作用的特点催化剂的共性用量少而催化效率高能够改变化学反应的速率，但是不能改变化学反应平衡降低反应的活化能，从而加速反应的进行一般要与反应物形成过渡态酶催化反应的特性专一性强催化效率高催化反应的条件温和酶和酶工程概论酶催化作用的特点一催化作用的专一性专一性：一定条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性.绝对专一性：一种酶只能催化一种底物进行一种反应相对专一性：一种酶催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应绝对专一性：一种酶只能催化一种底物进行一种反应构型专一性——立体异构选择性如：乳酸脱氢酶催化丙酮酸进行加氢反应生成的产物是L-乳酸。而D-乳酸脱氢酶催化丙酮酸生成的是D-乳酸。专一底物——如脲酶催化尿素的分解反应相对专一性：一种酶催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应键专一性——作用于相同化学键的一类底物，如酯酶基团专一性——作用于相同基团的一类底物，如胰蛋白酶，水解含有赖氨酰或精氨酰羰基的肽键，如酰胺类、脂类、蛋白质等等都可被胰蛋白酶水解。酶和酶工程概论补充：为什么酶催化具有专一性？酶催化作用专一性的机制酶分子的活性中心，一般都含有多个具有催化活性的手性中心，这些手性中心对底物分子构型取向起着诱导和定向的作用，使反应可以按单一方向进行酶能够区分对称分子中等价的潜手性基团，即一个具有潜手性基团的底物与酶结合后，将向着与酶结合位点构象相匹配的构型的方向发生转化酶和酶工程概论酶催化作用专一性的相关学说1、“三点结合”的催化理论酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现酶和酶工程概论酶催化作用的特点——专一性酶催化作用专一性的相关学说2、锁－钥学说整个酶分子的天然构象是刚性的，酶表面具有特定的形状酶与底物的结合，如同一把钥匙对一把锁一样酶和酶工程概论酶催化作用的特点酶催化作用专一性的相关学说3、诱导契合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状酶和酶工程概论酶催化作用的特点二酶催化作用效率高酶的催化作用可使反应速度提高107～1013倍例如：H2O2的分解反应Fe3+催化，效率为6×10-4mol/(mol·s)过氧化氢酶催化，效率为6×106mol/(mol·s)过氧化氢酶将H2O2分解反应的活化能从75.24kJ·mol-1降低到8.36kJ·mol-1非酶催化剂钯，将H2O2分解反应的活化能从75.24kJ·mol-1降低到48.94kJ·mol-1酶和酶工程概论酶催化作用的特点酶催化作用效率高活化能：在一定温度条件下，1mol的初态分子转化为活化分子所需的自由能称为活化能，单位J/mol。酶与非酶催化时所需的活化能示意图图中酶催化反应和非酶催化反应的活化能差异显著非酶催化反应酶催化反应活化能反应过程酶和酶工程概论酶催化作用的特点三酶促反应条件温和酶促反应一般在pH5～8水溶液中进行，温度范围为20～40oC，即通常的生理条件高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活原因：酶催化所需活化能低酶是生物大分子，易变性而失活酶和酶工程概论第三节影响酶催化作用的因素底物浓度酶浓度温度反应体系pH值抑制剂激活剂酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素一底物浓度对酶活的影响米氏方程（米彻利斯和曼吞）当底物浓度较低时，酶促反应速率与底物浓度成正比，符合一级反应动力学当底物浓度很高时，反应速率不随底物浓度的改变而变化，符合零级反应动力学酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素二酶浓度的影响在底物浓度足够高的情况下，酶催化反应速率与酶浓度成正比：酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素三温度对酶反应速率的影响表现：影响酶的稳定程度，酶蛋白在过高温度下将发生热变性影响最大反应速率影响酶和底物的结合影响酶和底物分子中某些解离基团的pKa值酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素最适温度（optimumtemparature）酶反应速率随着温度的升高达到一个最大值时所对应的温度它不是酶催化反应的特征值，受作用时间、底物浓度、酶浓度及反应的pH等条件影响温度提高时，在反应速率增加的同时，酶蛋白变性失活的速率也迅速增加，所谓的最适温度，实际上是这两种因素综合影响的结果酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素四pH值对酶反应速率的影响多数情况下，酶反应速度随pH的变化呈钟罩形曲线最适pH（optimumpH）酶反应速率随pH变化达到最大值时所对应的pH值不是常数，受许多因素影响酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素pH对酶及其反应系统的影响表现：1、改变酶空间构象，使酶可逆或不可逆变性失活当酶液的pH值恢复到最适pH时，活力可完全恢复的称为可逆失活，反之，则称为不可逆失活2、改变反应系统的组成成分，主要是影响酶、底物和酶－底物复合物的结合/解离状态影响酶活性中心基团的解离状态，使底物不能分解为产物影响酶分子中底物结合部位的解离状态，使其不能与底物结合影响底物的解离状态，使底物不能与酶相结合，或结合后不能生成产物酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素五抑制剂对酶反应速率的影响凡能降低酶催化反应速率的物质都称之为抑制剂抑制剂与酶的必需基团（包括活性基团及辅基）结合，改变其结构与性质，引起酶反应速率下降。（抗坏血酸抑制蔗糖酶）抑制剂对酶有选择性，不包括酶蛋白的水解及变性失活作用。酶抑制剂的特点:在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合物酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素——抑制剂抑制类型不可逆抑制抑制剂与酶的活性中心发生了化学反应，或共价地连接到酶分子的必需基团上，阻碍了底物的结合或破坏了酶的催化基团不能用透析或稀释的方法除去抑制剂，酶活性难以恢复。可逆抑制作用与时间有关。可逆抑制抑制剂与酶蛋白以解离平衡为基础，以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失抑制剂可以通过物理方法（如透析等）被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。可逆抑制作用与时间无关。酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素可逆抑制作用的类型竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素竞争性抑制：是指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用。抑制剂In和底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相排斥酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素竞争性抑制的速率曲线酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素非竞争性抑制：是指抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合而引起酶活性降低的抑制作用。酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导致酶活性下降。这类物质并不是与底物竞争酶的活性中心，而是与非活性中心结合，所以称为非竞争性抑制剂。酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素非竞争性抑制的速率曲线酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素反竞争性抑制：是指在底物与酶分子结合生产中间复合物后，抑制剂再与中间复合物结合而引起的抑制作用。抑制剂In不能和游离酶结合，只和酶－底物复合物ES结合成无活性的三元复合物ESIn，也是说S和E的结合不仅不排斥In，反而促进In和E的结合。酶和酶工程概论影响酶催化作用的因素反竞争性抑制的速率曲线酶和酶工程概论

影响酶催化作用的因素六激活剂对酶反应速率的影响表现：能够增加酶催化活性，或使酶催化活性显示出来的物质称为酶的激活剂或活化剂。常见的激活剂有无机离子（Ca2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Cl-等）和某些有机分子等。部分酶也可以作为激活剂激活作用的类型激活剂A与游离酶E相结合，形成活性酶复合物EA激活剂A与底物S相结合，形成复合的活性底物SA激活剂A与游离酶E、酶－底物复合物ES形成三元复合物EAS酶和酶工程概论第四节酶的分类与命名蛋白类酶（proteozyme，P酶）国际酶学委员会提出的酶的命名与分类方案六大类酶核酸类酶（ribozyme，R酶）分子内催化R酶（incisribozyme）分子间催化R酶（intransribozyme）酶和酶工程概论酶的分类与命名一蛋白类酶（P酶）的命名规则推荐命名法——底物名+催化反应类型+酶“水解酶”可以省略“水解”二字（如淀粉酶、蛋白酶等）有时可以加上酶的来源或特性（如胃蛋白酶等）系统命名法——底物名（供体：受体）+催化反应类型+酶如果反应中有多个底物，每个底物均需列出（水解反应中的水可省略），底物名称之间用“:”隔开若底物有构型，也需标出酶和酶工程概论酶的分类与命名P酶命名举例系统命名法——底物名（供体：受体）+催化反应类型+酶e.g.1:[EC1.1.1.1]乙醇脱氢酶——俗名乙醇：NAD+氧化还原酶——系统命名CH3CH2OH+NAD+

CH3CHO+NADH+H+——催化的反应e.g.2:[EC2.6.1.2]谷丙转氨酶——俗名丙氨酸：

-酮戊二酸氨基转移酶——系统命名丙氨酸+

-酮戊二酸丙酮酸+谷氨酸——催化的反应谷丙转氨酶主要存在于肝细胞浆内，是反映肝脏损伤情况的重要指标。一般只要有1%的肝细胞坏死，就可以使血清酶增高一倍。因此，谷丙转氨酶被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。

酶和酶工程概论酶的分类与命名P酶系统命名编号EC类.亚类.小类.序号EC：EnzymeCommission的缩写类——P酶的六大类氧化还原酶类（oxidoreductases）转移酶类（transferases）水解酶类（hydrolases）裂合酶类（lyases）异构酶类（isomerases）连接酶类（ligases）或合成酶类（synthetases）酶和酶工程概论酶的分类与命名P酶系统命名编号亚类——每个大类中，按照酶作用的底物、化学键或基团的不同，分为若干亚类小类——每一亚类中再根据某一种相同的性质划分为若干小类序号——每一小类中包括若干具体的酶，按照一定的顺序依次编号e.g.：

-D-葡萄糖氧化还原酶[EC1.1.3.4]氧化还原酶类反应在供体的CH—OH基上进行以氧为氢受体酶和酶工程概论酶的分类与命名P酶——氧化还原酶（oxidoreductases）催化受体A的氧化还原反应的酶：很多情况下需要辅酶（如NAD+、FMN等）参与系统命名——A：B氧化还原酶推荐名A脱氢酶（dehydrogenase）或A还原酶（reductase）以O2作为氢受体时——A氧化酶（oxidase）酶和酶工程概论酶的分类与命名P酶——转移酶（transferases）催化某基团X从供体化合物A转移到受体化合物B上的酶系统命名——A：B基团X转移酶L-丙氨酸：2-酮戊二酸氨基转移酶[EC2.6.1.2]推荐名——A基团X转移酶/B基团X转移酶L-丙氨酸+2-酮戊二酸（丙氨酸氨基转移酶）丙酮酸+L-谷氨酸酶和酶工程概论酶的分类与命名P酶——水解酶（hydrolases）催化化合物AB进行水解反应的酶系统命名——AB：化学键水解酶5’-核苷酸磷酸水解酶[EC3.1.3.5]（省略了“：水”）推荐名——AB（水解）酶5’-核苷酸酶（5'-nucleo