生长素对烟苗侧根发育和根系生长的影响

生长素对烟苗侧根发育和根系生长的影响

在植物生长过程中，根系起着非常重要的作用，包括为植物提供养分和固定植物。对于烟草来讲,其根系还参与烟碱的合成,而烟碱是烟叶品质评价的一个重要指标。由此可见烟草根系的重要性和特殊性。苗期是烟草生长的关键时期,当前烟苗多采用漂浮育苗法培养,烟苗根系在此时期的生长发育情况将直接决定其移栽后对环境的适应能力、生长情况和烟叶品质。如何培养出根系发达的烟苗是烟草行业的研究热点之一。在通过农艺措施(如耕作、栽培、施肥等)来促进烟根发育处于瓶颈的情况下,利用植物外源激素来调节烟草内各激素水平,以促进烟株根系的生长发育,从而改善烟叶品质是很有必要的研究方向之一。在5大类经典激素种类中,生长素在侧根生长发育过程中发挥着极其重要的作用,相关研究也比较多,但主要集中在拟南芥、玉米、水稻等植物上,而对烟草根系生长影响的报道较少。另外,外源生长素在不同时间处理下对侧根发育的关键基因有无影响也未见相关研究。基于此,系统研究了生长素对烟苗根系生长发育及特异性基因表达的影响,旨在找出能够促进烟苗根系生长发育的最佳生长素浓度和处理时间的组合,为烟苗的壮根提苗提供参考。1材料和方法1.1烟草种子及其营养液试验在湖南农业大学农业资源与环境专业实验室及基地进行。室内培养条件:昼温为(30±2)℃,夜温为(20±2)℃,光照为(10±1)h/d,光照强度约为800μmol/(m2·s),相对温度为75%~86%。烟草品种为湘烟4号和K326。用自来水和去离子水依次冲洗干净,置于装有珍珠岩的一次性杯子中,每个杯子中放四颗种子,于恒温培养箱中发芽。待发芽后,选取长势一致的幼苗,每杯留两株,每隔3d浇一次营养液。营养液为Hoagland完全营养液:KNO35mmol/L,KH2PO41mmol/L,MgSO47mmol/L,Ca(NO3)2•4H2O5mmol/L,Fe-EDTA3mmol/L,B0.5mg/L,Mn0.5mg/L,Zn0.05mg/L,Cu0.02mg/L,Mo0.01mg/L。烟苗在前45d的营养液为稀释5倍的完全营养液,45d之后则为正常完全营养液。1.2试验处理1.2.1正常营养液中生长素的应用幼苗在正常营养液中培养50d以后进行激素(生长素)处理,生长素浓度为:0、6、30、120、240μmol/L(在正常营养液中添加生长素);处理0、12、24、48、72、120h后转入正常营养液中,在转入正常营养液30d后测定根系性状特征。培养过程中每5d更换一次营养液,并用NaOH或HCl溶液调节营养液pH值,使其始终保持在5.5左右。1.3测量1.3.1湿根的切短、成湿和干的选择用一个铁制平盘(30cm×40cm),将框格放于平盘底部。再将湿根放入盛有浅水的盘里,用镊子把根系放于框格之上,使其彼此不重叠,较长的根或分枝侧根可适当切短。计算根与框格的垂直线与水平线的交叉点,用计算器依下列方程式计算出根长,即:根长=11/14×交叉数×框格单位。1.3.2侧根数测量用镊子把烟草根系置于盛有浅水的铁盘中,使其彼此不重叠,较长的根或分枝侧根可切成较短的一段,然后数侧根的数目。1.3.3观赏主根的长度和其他根的长度1.3.4rna的提取采用PrimerPremier5.0软件设计管家基因引物序列和目的基因引物序列。管家基因(actin)引物序列ACTIN-F:5’GCTATGCTACATTTCGCTTGACTAC3’,ACTIN-R:5’CTTGTCCATCAGGCATCGCTT3’;目的基因(RSI-1)引物序列:RSI-1-F:5′GCGAGCATGGGACTCGTAAA3′,RSI-1-R:5′GCGACTAAGATGTGGTGCGAGT3′。取50~100mg烟苗根系加液氮研磨至粉末状,置入1.5mL离心管中,加入1mLTrizol充分匀浆,室温静置5min。然后加入0.2mL氯仿,剧烈振荡15s,静置3min。再在4℃、12000r/min离心10min取上清液。再加入0.5mL异丙醇,混匀,冰上静置20~30min。再在4℃、12000r/min离心10min弃上清液。接着加入1mL75%乙醇,洗涤沉淀。再在4℃、7500r/min离心5min弃上清液。最后在室温放置晾干或在超净台中吹干(5min左右),加入适量的Rnase-freeH2O溶解。琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取质量。在0.2mLPCR管中加入反应试剂,然后70°C温浴5min。再冰浴10s,离心,37°C温浴5min。接着42°C温浴60min。最后70°C温浴10min。终止反应。将上述溶液于-20°C保存。将cDNA样品稀释8倍作为模板上机检测。配制反应混合液并设定PCR循环条件;完成上述步骤后,把加好样品的96孔板放在ABISteponeplus型荧光定量PCR仪中进行反应。1.4rosoft软件的分析试验数据的处理和相关分析用MicrosoftExcel2003和SPSS软件完成。处理间的差异显著性在0.05水平上进行方差分析。2结果与分析2.1不同生长素浓度对烟苗根系生长的影响图1为不同生长素浓度及时间处理对烟苗根系生长性状的影响。由图1看出,受不同生长素浓度及时间处理的影响,表现出适宜的生长素促进烟苗的侧根数、侧根长、总根长在增加,过高的生长素浓度则起抑制作用。各生长素浓度下,不同的时间处理没有表现出明显的规律,但总体上表现为12h处理对烟苗根系的生长较为有利。总的来说,120μmol/L的生长素处理12h的烟苗侧根数、侧根长及总根长最大,其次,30μmol/L的生长素浓度处理12h效果较好。2.2在一定的生长素浓度下，不同时间的处理对烟苗根系的发育有影响2.2.1不同处理时间对烟苗侧根数及总根长的影响图2为120μmol/L生长素浓度及不同时间处理的烟苗根系性状特征。从图中看出,烟苗主根长受生长素处理时间的影响较小;但不同处理时间对两个品种烟苗的侧根数及总根长有所影响,其中侧根数随着处理时间的增加表现出先增加后减少的趋势,在12h处理下两个品种烟苗的侧根数均达最高水平,其次为24h处理。烟苗总根长也表现出相似的变化趋势,以12h处理下的烟苗总根长最大,其次为24h处理。由此说明,在特定生长素浓度下,处理时间长短会对烟苗的根系发育产生影响。2.2.2不同品种生长素对烟草根系生长和生物累积的影响图3为120μmol/L生长素浓度的不同时间处理对烟苗地上、地下部生物累积量及根冠比的影响。从图中看出,特定浓度下合适的处理时间可以促进烟苗地上、地下部的生物量累积。处理时间的长短对两个品种烟苗地上部生物累积量的影响有所差异,其中湘烟4号以12h处理最大,其次为24h处理;K326则以5h处理最大,其次为12h处理,说明不同品种对生长素的敏感性存在差异。特定生长素浓度下处理时间的长短对烟草根系生长有影响,且两个品种差异较为明显。其中湘烟4号以24h处理的地下部生物累积量最大,K326品种则以5h最大;另一方面,湘烟4号烟苗地下部生物累积量在12~96h处理间无明显差异,而K326品种随着生长素处理时间的延长,地下部生物累积量呈现明显下降的趋势,说明K326品种烟苗对生长素处理时间长短要比湘烟4号敏感。随着生长素处理时间的增加,两个品种烟苗的根冠比呈现增加的趋势,由此可见,一定生长素浓度下处理时间长短会影响烟苗的生理代谢水平,导致地上及地下部生物累积量发生变化,最终影响其根冠比。2.2.3生长素对rsi-1基因表达的影响图4为生长素浓度下不同时间处理后两个品种烟苗根系RSI-1基因相对表达量的情况。从图4中看出,在120μmol/L生长素浓度下处理时间长短会影响烟苗根系RSI-1的相对表达量,RSI-1基因的表达量随着时间的延长呈现出先升高后下降的变化趋势,生长素处理5、12h后RSI-1基因的相对表达量处于较高水平,其中5h处理后的基因表达量最高。3生长素处理烟苗根系生长外源生长素对植物根系发育的影响已有报道,结果表明一定浓度的生长素及其类似物处理都能够较好地促进植物根系的生长发育。欧阳立明等研究表明,生长素(IAA)可以显著促进黄瓜幼苗主根伸长,增大根系比表面积。周索等指出,一定浓度下的生长素能够抑制拟南芥主根生长,促进不定根的生长发育。陈平芳等研究发现,添加一定量的生长素对高山杜鹃试管苗有明显的促根作用。李小方等研究表明,0.4~1.0mg/LIAA能够显著促进大白菜不定根的发生。烟苗一般采用漂浮育苗,移栽后根系欠发达的烟苗返苗能力较弱,因此设法培育出根系发达的烟苗对于烟苗后期的生长具有重要意义。通过一些农艺措施来壮苗的相关研究较多,而用生长素处理来促进烟苗根系生长的相关研究较少。本试验结果表明,不同浓度生长素处理对烟苗根系生长发育的影响不同,且在生长素处理浓度确定的情况下,不同时间处理的烟苗根系特定基因表达量有所差异。生长素处理促进了烟株根系的生长发育,表现为根干物质累积增加,根系活力提高,根系代谢能力也有所提高。RSI-1基因被认为可能是控制侧根原基发生的开关基因,它在侧根原基发生启动过程中起关键性的作用,并决定侧根原基的发生强度,此基因对侧根发育的促进作用途径与生长素作用途径有关。外源生长素对侧根开关基因(RSI-1)的研究国内报道很少。本试验在前人研究的基础上,利用RT-PCR技术检测了生长素不同处理时间对侧根原基关键基因RSI-1相对表达量的影响;结果表明,与生长素对烟苗侧根数的影响规律基本一致,但基因表达的速率快于生理反应速率,侧根数最多的一组处理时间为12h,而RSI-1基因表达量的峰值出现在处理时间为5h的那组,表明基因表达的速率略快于生理反应。外源生长素浓度及处理时间长短与RSI-1基因表达量、烟草根系生长有较为密切的关系,生长素浓度及处理时间长短会影响烟草根系的生理生化代谢及特定