不同大鼠皮肤药物质量浓度与曲线图研究酮康唑凝胶经正常大鼠和糖尿病大鼠皮肤透过性的差异

不同大鼠皮肤药物质量浓度与曲线图研究酮康唑凝胶经正常大鼠和糖尿病大鼠皮肤透过性的差异

糖尿病（metis）是一种由多种原因引起的慢性代谢性疾病，以高血糖为特征。糖尿病患者皮肤组织的糖原含量增高,容易并发各种真菌、细菌和病毒感染,在糖尿病的各个时期,可出现多种皮肤病变,糖尿病患者罹患皮肤病的比例约占25%～30%。酮康唑(ketoconazole,KTZ)为化学合成吡咯类抗真菌药,具广谱抗真菌作用,对全身真菌感染、深部真菌感染、表皮真菌感染均有效。酮康唑口服可引起多种毒副作用,如肝毒性、胃肠道反应等,目前主要以外用为主。微透析技术是将灌流取样和透析技术结合起来的一种新型生物采样技术,现已广泛应用于药物代谢、毒理、药动学、行为神经化学和内分泌学等领域,具有样品纯净、不需要做前处理的优点,是目前研究活体药物组织分布、药物组织穿透力及监测药物有效浓度的可靠方法。糖尿病患者皮肤与健康人皮肤在使用酮康唑经皮给药制剂时是否存在差异性,目前尚未见文献报道。本文采用微透析(microdialysis)技术对酮康唑凝胶经正常大鼠和糖尿病大鼠皮肤透过性的差异进行研究,以期对酮康唑的临床应用提供参考。1仪器和试剂1.1gc/ms色谱条件OneTouchUltra2血糖仪及试纸(美国强生公司生产);SevenMulti酸度计(METTLERTOLEDO生产);PB110S电子天平(德国Sartorins公司);Agilent1200Series液相色谱仪,Agilent6460三重四极杆液相色谱/质谱,AgilentMassHunter色谱管理系统(美国Agilent公司);BG型超纯水仪(美国托普仪器有限公司);微透析设备:CMA/402微透析泵、微量注射器(1.0mL及2.5mL规格)、CMA20Elite同心环形微透析探针(简称Y型探针,OD500μm,活性透析膜长度为10mm,分子质量截留值为20ku,瑞典CMA公司)。1.2检定所和标准表链脲佐菌素(streptozocin,STZ,Sigma公司);酮康唑对照品(中国药品与生物制品检定所,批号100294-200602);酮康唑凝胶(自制,质量分数2%,原料药的质量分数≥99%,广州越迪化工有限公司分装);内标为地西泮(DZP,Sigma公司);高效液相试剂甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯;枸橼酸、枸橼酸三钠均为分析纯;水为双蒸去离子水;其他试剂均为分析纯。1.3实验动物中心提供SPF级雄性Wistar大鼠,体质量(230±10)g,由南方医科大学实验动物中心提供,合格证号为SCXK(粤)2006-0015。2方法2.1造模、注射及结果将20只SPF级雄性Wistar大鼠用常规饲料喂养2周后,禁食12h,于次日清晨空腹状态下测血糖浓度(bloodglucoseconcentration,BGC),剔除血糖过高(>6mmol·L-1)或偏离正常值较大的动物。称质量,选取12只随机分为2组,每组6只,分别为正常对照组和糖尿病模型组(DM组),DM组大鼠一次性腹腔注射用0.1mol·L-1(pH4.4)枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液溶解的质量分数1%STZ进行造模,注射剂量45mg·kg-1,正常对照组大鼠单次腹腔注射等体积的0.1mol·L-1(pH4.4)枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。注射后3、7、14、28d分别用美国强生血糖仪测尾尖血糖,以血糖>16.7mmol·L-1作为糖尿病成型标准。2.2丙酮醇lc-ms和ms检测方法的建立2.2.1对照品储备液的制备灌流液(Ringer液)的配制:将NaCl7.5g、KCl0.2g、CaCl20.4g,用蒸馏水溶解并稀释至1000mL,得Ringer液,每次需用0.22μm滤器滤过后再使用。酮康唑甲醇液的配制(供建立质谱方法用):精密称取酮康唑对照品0.001g,用甲醇溶解并稀释,定容至100mL,得10mg·L-1的酮康唑对照品储备液。内标甲醇溶液的配制:将购得的1mg·mL-1地西泮甲醇溶液用甲醇稀释至100ng·mL-1备用。2.2.2苯甲酸-乙腈条件色谱条件:色谱柱为Agilent,ZORBAX-C18色谱柱(4.6mm×50mm,1.8μm);流动相为0.1%(体积分数)甲酸-乙腈(体积比30∶70);流速为0.3mL·min-1;进样量为10μL;柱温为30℃。质谱条件:采用电喷雾二级质谱,ESI源,使用全扫描一级质谱(MS2Scan),正离子检测,多重反应检测模式(MRM),脱溶剂温度为350℃,脱溶剂气流速为11L·min-1,裂解电压、碰撞能量、扫描离子片段等参数见表1。2.2.3特征液质及色谱图取颈静脉与腹部皮下空白基质灌流液、酮康唑溶液和内标灌流液、加了内标的微透析样品溶液,分别依法测定,酮康唑特征液质图谱见图1。可见,空白基质谱图中,颈静脉及皮下基质中均未检测到药物,说明无干扰(图1A、B);酮康唑出峰时间约为1.8min(图1C),地西泮出峰时间约为3.4min(图1D);微透析颈静脉样品加入内标后,酮康唑与内标完全分离(图1E)。2.2.4标准曲线的绘制精密量取酮康唑储备液,用空白灌流液稀释,分别配制1、5、10、25、50、100、250、500、1000、2000、3000、4000、5000ng·mL-1酮康唑系列溶液,每个质量浓度精密量取45μL,加入7.5μL内标后,进样10μL测定,以酮康唑和内标的峰面积比值为横坐标,样品中酮康唑质量浓度为纵坐标绘制标准曲线。所得标准曲线回归方程为Y=901.74X+1.59(r2=0.9957),线性范围为1～5000ng·mL-1。当信噪比S/N=5时,确定最低定量限为1ng。2.2.5方法的精密度按“2.2.4”项下方法分别配制低、中、高(5、1000和4000ng·mL-1)3个质量浓度的样品,在1d内测定5份样品,计算日内精密度,每日测定1份样品,重复测定5d,计算日间精密度。结果测得低、中、高3个质量浓度的样品溶液的日内精密度RSD值分别为3.46%、0.92%、0.93%,日间精密度RSD值分别为3.62%、0.78%、1.03%,RSD值均<3.62%,说明本方法精密准确,符合相关要求。2.2.6基质对药物检测的影响同时考察颈静脉和腹部皮下样品的基质效应。选低、中、高(5、1000、4000ng·mL-1)3个质量浓度的样品,各取0.1mL溶液分别加入小EP管中,分别加入颈静脉空白基质、皮下空白基质及空白灌流液10μL,涡旋混合均匀,每种基质每个质量浓度各做3个样本,基质与空白灌流液样品结果相比,基质效应都比较接近1,说明基质对药物检测的影响很小,不影响准确测定,结果见表2。2.3在体微析的基础上2.3.1灌流液的相对损失率测定分别在大鼠颈静脉和腹部皮下各埋植1支探针,用5000ng·mL-1的KTZ林格液进行灌流,平衡60min左右后开始收集灌流液,45min收集一管,连续收集5管(每次约45μL)。分别将灌流液和透析液注入色谱仪,测定药物质量浓度,分别记为ρ灌注液和ρ透析液。相对损失率(relativeloss,RL)=(ρ灌注液-ρ透析液)/ρ灌注液×100%。每只大鼠的在体损失率为5个点的均值,共做5只大鼠,计算均值用于微透析实验结果的校准。2.3.2大鼠颈静脉内固定期过流法雄性Wistar大鼠用质量分数10%水合氯醛水溶液腹腔注射麻醉(30mg·kg-1)后,仰位固定于鼠板上。用电剃刀除去腹部鼠毛,在腹部皮肤上选择植入点,用注射器针头从植入点插入需要采样的部位及深度,抽出注射器留下套管以固定位置,再将探针送入套管中,然后缓慢抽离套管,边往外拉边撕除套管,直至整根套管被撕开。整个操作过程,探针中保持1μL·min-1的灌流速度。与此同时,在大鼠右颈部剪开1个0.5cm的切口,钝性分离颈静脉,扎闭远心端,用小手术剪在血管上剪开1个小口,将探针朝向右心室方向植入颈静脉中,并用缝合线将探针与颈静脉结扎固定,然后取蘸有生理盐水的棉球遮蔽颈部手术伤口部位,打开手术照明灯为大鼠身体保温。整个操作过程,探针中一直保持1μL·min-1的灌流速度,并在以下的整个实验中保持不变。待手术平衡60min左右后,用双面胶将玻璃给药器固定于大鼠腹部埋植探针透析膜的皮肤上(给药器内径约为2cm),加约2g酮康唑凝胶于给药器中,开始收集透析液,每45min收集1管样品,连续取样12管(9h左右),采用LC-MS/MS法测定样品中药物质量浓度,用体内回收率校正后,绘制药物的质量浓度-时间曲线图。微透析采集的样品质量浓度经回收率校正后即为动物组织中真实的药物质量浓度,此质量浓度为采样间隔时间内的平均值,故以采样间隔的时间中点(middle-pointtime)作为横坐标。2.4药动学参数检测计量资料统计结果以ˉx±sx¯±s表示。正常对照组与DM造模组大鼠造模前及造模后4周血糖及体质量采用Prism5.0软件做图。微透析测得的皮下和颈静脉药物质量浓度数据采用Winnonlin软件计算Cmax、Tmax、AUC等药动学参数。数据均采用独立样本t检验进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。3结果3.1大鼠体质量和血糖造模前,大鼠皮毛光泽油亮、顺滑,精神状态佳,行动敏捷,粪尿正常。STZ注射1周后,大鼠发生较明显变化,精神渐萎靡,活动明显减少,皮毛干燥粗糙,尿量增多。造模前和造模4周后大鼠体质量变化曲线见图2。可见,造模前2组大鼠的体质量差异无统计学意义(P>0.05);造模后,正常组大鼠体质量增加,造模组大鼠体质量降低,2组大鼠体质量变化有统计学意义(P<0.05)。造模前和造模4周后大鼠血糖变化曲线见图3。可见,造模前2组血糖均在正常范围内,差异无统计学意义(P>0.05);造模组血糖有显著性升高,正常组大鼠血糖基本维持不变,2组大鼠造模前后血糖差异有统计学意义(P<0.05)。3.2腰椎在体损失率颈静脉微透析探针在体损失率为(78.17±8.10)%(ˉx±s‚n=5)(78.17±8.10)%(x¯±s‚n=5),腹部皮下在体损失率为(54.54±4.48)%(ˉx±s‚n=5)(54.54±4.48)%(x¯±s‚n=5)。3.3大鼠脏器正常皮给药后的药动学将测得透析液中的药物质量浓度用在体损失率校正后,所得结果即为取样部位的真实药物质量浓度,计算公式为ρ真实=ρ测量/(1-RL)。酮康唑凝胶经皮给药后大鼠腹部皮下的药物质量浓度-时间曲线见图4,药动学参数见表3。可见,酮康唑凝胶经皮给药后,糖尿病大鼠腹部皮下组织中的Cmax及AUC明显高于正常组大鼠,差异具有统计学意义(P<0.05),而Tmax的差异则无统计学意义(P>0.05)。酮康唑凝胶经皮给药后大鼠颈静脉中酮康唑质量浓度-时间曲线见图5,药动学参数见表4。可见,酮康唑凝胶经皮给药后,糖尿病大鼠颈静脉的药物质量浓度-时间曲线与正常大鼠的基本重合,2组大鼠的Cmax、AUC、Tmax差异均无统计学意义(P>0.05)。4stz注射途径和探针回收率关于糖尿病大鼠模型是否造模成功的标准并非很明确,只要出现多饮、多食、多尿等现象可认为造模成功,也有报道认为血糖>11.1mmol·L-1即可认定造模成功。本研究采用45mg·kg-1STZ的给药剂量建立大鼠Ⅰ型糖尿病模型,成功率达到90%以上,相比很多文献报道的较高剂量,如普遍认定的60mg·kg-1,效果同样显著。用STZ诱导糖尿病模型,具有造模时间短、发病时间整齐和病情严重程度较统一等特点,而且这种造模技术容易掌握。STZ注射途径有腹腔注射和尾静脉注射,尾静脉注射较难掌握,易出现操作误差,而腹腔注射易操作、准确、快速。STZ很不稳定,遇水极易分解,所以要避光保存及操作,配制时也需要注意在冰浴操作;腹腔给药时,速度不可过快,否则容易造成大鼠死亡,速度过慢也可能影响造模成功率,应在配制STZ溶液后30min内完成造模。微透析技术的关键问题就是如何对取出的样品进行准确可靠的校正,这就涉及到对探针的回收率的测定。微透析探针主要由具有一定分子量截留值的半透膜组成,探针回收率是指从灌流液中流出的待测组分与标准浓度之比的百分数,在需要了解待测部位的实际浓度时必须测定回收率。本文结果显示,酮康唑凝胶剂经皮给药后,糖尿病大鼠腹部皮下的药物质量浓度均明显高于正常大鼠组,其Cmax及AUC与正常组大鼠的差异均有统计学意义,说明糖尿病导致的皮肤