植物组织培养中的消毒剂

植物组织培养中的消毒剂

近年来，植物组织培养技术在育种、解毒、快速栽培、次生产、人工育种和物种低温保存等方面得到了广泛应用。然而，由于技术本身的一些特点，该技术的应用有限，其中培训材料容易被污染是该技术面临的重要问题之一。本文从物理方法、化学方法和生物技术三个方面对前人进行了简要论述，并提出了未来植物群培养中无菌处理技术的发展方向。1化学剂在植物群的形成中的应用化学灭菌方式在植物组培中的应用非常广泛,其方法是在组培中使用无机或有机化学物质进行灭菌.1.1无机洗剂1.1.1无机消毒技术的消毒效果在植物组培中,无机消毒剂在外植体消毒方面的应用相当广泛.周峰等利用84消毒液、升汞和双氧水对毕氏海蓬子种子和幼苗进行消毒处理得出,毕氏海蓬子下胚轴用体积分数为20%的84消毒液处理10min后,其抗污染率可达93%;对海蓬子种子用质量分数为0.1%的升汞处理15min后,种子的抗污染率可达97%.张强等在除虫菊种子及幼苗消毒方法的研究中发现,以10%次氯酸钠消毒30min的污染率仅为3.33%,幼苗以0.1%HgCl2处理4min的成活率达90%.任敏等用0.1%HgCl2对外植体进行消毒都取得了很好的消毒效果.也有报道,溴水、硝酸银等具有明显的消毒效果.可见,在外植体的消毒过程中使用恰当的单一无机消毒剂进行消毒的效果良好.周锦霞等以油樟的带芽茎段为材料,在初代培养中进行了不同的表面消毒试验,发现Ca(ClO)2和HgCl2配合使用有助于污染率的降低.魏晓兰对三倍体毛白杨的外植体进行消毒时发现,带芽茎段在漂白粉饱和上清液中浸泡30min,再以0.1%的升汞浸泡15min,消毒效果较好.何宗明等以巴戟天茎段为试材,发现最佳消毒方式是0.1%升汞8min+2%次氯酸钠10min.各种无机消毒剂的消毒原理不同.氯化汞或硝酸银的杀菌原理是Hg2+或Ag+可与带负电荷的蛋白质结合,使细菌蛋白变性、酶失活.含氯消毒剂的杀菌作用包括次氯酸的作用、新生氧作用和氯化作用.次氯酸的氧化作用是含氯消毒剂的最主要的杀菌力所在.含氯消毒剂在水中形成次氯酸,作用于菌体蛋白质.次氯酸不仅可与细胞壁发生作用,且因分子小,不带电荷,故侵入细胞内与蛋白质发生氧化作用或破坏其磷酸脱氢酶,使糖代谢失调而致细胞死亡.当前虽没有对单一的无机消毒剂和一种以上无机消毒剂配合使用的消毒效果进行深入研究,但从消毒原理上我们可以推测无机消毒剂混合使用的效果要优于单一使用.另外,氯化汞消过毒的外植体材料要用无菌水反复多次洗涤以将药剂除净.氯化汞也会给环境造成较大污染,应尽量减少或不用氯化汞为宜.1.1.2臭氧消毒和无机消毒法组培中的污染主要是由微生物引起的,微生物本身很小,在空气中又无处不在,因此,减少培养环境的微生物对降低组培的污染率至关重要.邱广伟等在马铃薯脱毒试管苗工厂化生产中,每隔4~5d对无菌室每立方米空间用甲醛与高锰酸钾按3∶1的比例封闭熏蒸24h,污染率明显降低.向组培环境中通入臭氧是时下广泛应用的消毒措施,臭氧在常温、常压下分子结构不稳定,很快自行分解成氧气和单个氧原子,后者具有很强的活性,对细菌有极强的氧化作用,它不仅对各种细菌有杀灭能力,而且对杀死真菌孢子也很有效,由于使用臭氧消毒不存在任何有毒残留物,因而也很符合当前的环保要求.现在应用于植物组培环境消毒的措施很多,比如使用专用的熏蒸器进行熏蒸消毒和在组培环境中喷洒农药等也都常用.与紫外光直射灭菌和药物喷洒灭菌相比,通臭氧或无机消毒剂熏蒸均能弥散到组培环境中的背阴、角落或小缝穴等处.1.2有机消毒1.2.1抗菌消毒技术刘艺平等将薄叶系文心兰花梗用70%乙醇浸渍10秒的前处理效果较好.张艳玲等发现在其它消毒剂中添加吐温-80,可降低芳香植物唇萼薄荷组培中的污染率.孙阳等、何宗明等对外植体用洗衣粉进行清洗和消毒也取得了良好的效果.贾云超等用0.12mg/mL抗菌肽溶液浸泡棉花去壳种子有效地防止了棉花组培中常有的真菌污染,而对棉花根系的发育无影响.刘雪红等采用70%的乙醇处理30s,0.1%的升汞加3~5滴吐温20消毒6min既能很好地控制冬枣组培的污染.在植物组培中用于外植体消毒的有机消毒剂还有多菌灵、甲基托布津、洗衣粉等.酒精能吸收细菌蛋白的水分,使其脱水变性凝固,从而杀灭细菌.多菌灵为高效低毒内吸性杀菌剂,有内吸治疗和保护作用,可干扰病原菌有丝分裂中纺锤体的形成,影响细胞分裂.吐温作为一种表面活性剂能显著增强其它消毒剂的消毒效果.1.2.2多种有机物制剂的使用对植物的抑菌效果郑丽娜等在百合脱毒培养基中添加病毒唑结合热处理的方法较好.病毒唑是广谱强效的抗病毒药物,临床上应用于病毒性疾病的防治,应用于植物组培尚属首例.王丹等研究了山梨酸钾在红豆杉开放式组培中的抗菌作用,结果表明,0.02g/L和0.04g/L山梨酸钾的抑菌效果较好,抑菌时间最长,在红豆杉的开放式组织培养中未出现青霉和黑曲霉,且菌块生长较慢.蔡建荣等以“林畬早薯”山药茎段为外植体,发现在培养基中添加25mg/L苯甲酸钠的抑菌效果良好,经高温处理和常温下过滤处理的苯甲酸钠在植物组培养中的抑菌效果区别不显著.山梨酸分子能与微生物细胞酶系统中的巯基结合,从而达到抑制微生物生长和防腐目的.山梨酸钾对细菌、酵母和霉菌均有抑制作用,但对厌气性微生物和嗜酸乳杆菌几乎无效.其防腐作用较苯甲酸更广,苯甲酸虽也有防腐作用,但对人体有一定的毒副作用,因此,在实践中建议选用山梨酸钾替代苯甲酸.李春香等通过实验证实了壳聚糖对组培污染菌类有很好的抑制作用,在花卉组培污染防治方面具有应用价值.李晓莺等在枸杞继代培养物中加入不同浓度的农用杀菌剂,结果发现,75%的代森锰锌可湿性粉剂对组培中出现的真菌污染具有显著的防治效果,污染率仅10%,且枸杞培养物的生长情况良好.代森锰锌是一种广谱保护性杀菌剂,其作用机理是抑制菌体内丙酮酸的氧化,同时可为植物提供锌元素,除解决缺锌的症状外,给植物增强抵抗病害的能力,从而间接地起到杀菌作用.许婉芳等将不同杀菌剂加入金线莲培养基中,发现50%的多菌灵的效果优于70%的甲基托布津和25%的甲霜灵,其抑菌率达100%.可见,多种有机化学消毒剂都可以添加于组培用的培养基中,起到良好的抑菌效果,但目前缺乏多种有机化学消毒剂配合使用的系统研究.2生物洗剂在植物组中的应用2.1抗菌药的抑菌效果抗生素可干扰病原微生物的代谢过程,如抑制细菌细胞壁的合成、影响细菌细胞膜的通透性、抑制菌体蛋白质的合成、抑制细菌核酸的合成等,从而起到抑菌或杀菌作用.周俊辉等利用不同浓度、不同种类的抗生素做抑菌实验的结果表明,在同等浓度下庆大霉素对细菌产生了明显的抑制作用,青霉素与氯霉素也能抑制细菌的生长,但抑菌效果不如庆大霉素,四环素明显的抑菌作用.随后,很多学者在植物组培的无菌处理环节上使用了抗生素.2.1.1抗菌、抗菌的处理SoubirTitov等将等量外植体分别浸泡在含400mg/L氨苄青霉素和200mg/L庆大霉素的溶液中1h,发现经抗生素处理过的外植体开始死亡.陈娟等在研究控制生姜组织培养污染率的过程中发现,用硫酸卡那霉素和硫酸庆大霉素溶液浸泡外植体能有效控制污染,同时不会抑制芽的生长,但用头孢氨苄的效果次之,青霉素的抑菌效果不理想.黄天带等研究发现,1g/L多菌灵、800mg/L羧苄青霉素钠和500mg/L噻孢霉素混合后处理外植体,真菌和细菌污染率都显著下降.以上的应用说明,利用抗生素预处理外植体时必须筛选合适的种类、掌握恰当的浓度和处理时间.2.1.2不同抗菌药物组合抗生素溶液除了用于外植体的消毒灭菌,还可加入到培养基中起到持续抑菌的作用,从而减少组培中的污染,尤其对植物内生菌的抑制有明显的作用.目前,使用单一抗生素进行抑菌的研究较多,陈灵等用注射器在邓恩桉分化培养基和生根培养基中加入不同浓度的不同抗生素,发现附加氨苄西林钠100mg/L,对当代污染菌的抑菌率为100%,同时在增殖系数、苗高、生长势、试管苗生根等方面也都表现最好,硫酸链霉素抗菌效果次之但对试管苗产生毒害,庆大霉素抗菌效果不佳.田永亮等在引进的2个葡萄品种维德和南方无核的组培中,在其初代培养基中分别加入不同浓度的青霉素20mg/L和40mg/L、四环素20mg/L和40mg/L来抑制真菌和细菌的生长,结果表明四环素的抑菌作用比青霉素的更好,两种抗生素在试验浓度下都没有对植物体产生毒害作用,可应用于实际生产.张永平等以女王竹芋分蘖芽为材料,发现在培养基中添加庆大霉素可抑制共生菌造成的污染,其最佳浓度为60mg/L.邢东方等在枣组织培养中发现可使用150mg/L头孢霉素来抑制污染.梁明勤等在白网纹草组织培养中加入20~30mg/L的土霉素,污染率降低25个百分点以上.蒋泽平等采用医用抗生素氨苄西林钠、硫酸链霉素、头孢拉定及其组合抑制黄叶日本桃叶珊瑚试管苗细菌污染试验结果表明,单独使用1种抗生素时,抗菌及试管苗生长、生根情况不如组合使用效果好,附加氨苄西林钠与硫酸链霉素各50mg/L,对污染菌的抑菌率为100%,氨苄西林钠与头孢拉定抗菌组合效果次之,效果好于硫酸链霉素与头孢拉定组合.许婉芳等将不同抗生素加入金线莲培养基中,抑制细菌和霉菌的生长,取得良好效果,最佳抗生素组合为制霉菌素40U/ml、卡那霉素40U/ml、庆大霉素200U/ml.2.1.3细菌污染效应在植物组织培养的过程中,已污染的外植体仍可以用抗生素进行抢救,以减少损失.时群在红掌组培继代培养基中加入5~20mg/L硫酸阿米卡星,有效地控制了轻度污染.由翠荣等在迷你玫瑰组织快繁体系连续继代过程中,发现培养基中加入氨苄青霉素50~150mg/L抑制了污染菌生长,加入硫酸丁胺卡那霉素25~100mg/L进一步杀灭了污染菌.李春燕等针对银白杨组织培养细菌污染严重的问题,采用400万或600万单位的青霉素无菌水溶液处理细菌污染苗,分别浸泡60min或40min可有效控制其污染.高建莉在菊花培养基中附加50~150mg/L的氨苄青霉素和50mg/L的硫酸丁胺卡那霉素,起到抑制细菌生长的作用,培养物生长良好.2.2中草药消毒的杀菌效果唐历波采用野生灵芝10g于1000ml蒸馏水中煮2h的浸出液配制培养基,不仅能使香蕉正常生长,而且已感染细菌的材料经一段时间培养后,细菌污染消失.李文凯等将苍术用于接种车间和培养车间的灭菌,结果发现苍术熏蒸的灭菌效果与紫外线照射及甲醛熏蒸无显著差异灭菌消毒效果维持的时间较长,而且对人体无刺激和毒副作用.王金和等为研究中草药消毒