多花黄精组培快繁体系的建立

多花黄精组培快繁体系的建立

黄精是百合科多年生草本植物的黄精。它可以补充精华（p.王子ii）和黄鼠尾（p.c.yrtonema）的根，具有润肺阴虚、补充中度补气、益肾和填充粘液的功效。近代研究表明,黄精含有烟酸、醒类、豁液质、淀粉、二氨基丁酸、黄精多糖及低聚糖等成分,有麻醉及降低动物血压的作用,对肾上腺素引起的血糖过高有抑制作用,对防止动脉粥样硬化及肝脏脂肪浸润、对改善肾脏功能也有较好功效。黄精还是一味抗菌良药,对伤寒杆菌、结核杆菌、金黄色葡萄球菌及皮肤癣菌等均有一定抑制作用。近年来,本品已广泛应用于冠心病、高血压、糖尿病、肺结核、再生障碍性贫血,以及预防放疗、化疗引起的副作用等,取得了较好的疗效。随着市场需求量不断增加和野生资源不断减少,黄精人工栽培已成为市场供求之主体。黄精繁殖方式主要是有性繁殖(种子)和无性繁殖(根茎)两种方式。由于黄精种子难收集,种子发芽率低,而且种子繁殖,育苗时间又长,这样就大大增加了黄精的栽培成本,不利于黄精的人工大面积种植。所以在当前的人工栽培中,繁殖主要依靠根茎的无性繁殖,但该方法繁殖系数低,种根茎用量大,既不经济,又限制了黄精的产量潜力,不便栽植管理推广。因此,黄精种苗问题成了人工大面积种植的瓶颈。而现有黄精栽培基地的黄精品种也迫切需要对其进行提纯复壮,以培育高产抗病脱毒的种苗。关于黄精的组织培养,徐忠传、徐红梅等学者已做过研究。徐忠传等以黄精根茎段芽端为外植体,在附加6-BA4.0mg/L和NAA0.2mg/L组合的MS培养基上培养可得到无根根茎芽;再将其在附加NAA0.5mg/L的MS生根培养基上培养,生根率可达百分之百。徐红梅等以黄精根茎萌发形成的不定芽横切片为外植体,研究了不同植物生长调节剂对多花黄精芽体外发生过程中性状的影响。认为,多花黄精的体外快速繁殖可通过以下途径实现:TDZ1.5mg/L和2,4-D1.0mg/L的组合诱导不定芽,6-BA(1.0～2.0)mg/L和NAA(1.0～2.0)mg/L的组合诱导健康叶片的发育,1/2MS+(NAA,IBA,IAA)或2,4-D(0.5～1.0)mg/L诱导生根;6-BA2.0mg/L和2,4-D(1.0～2.0)mg/L的组合用于繁殖以药用器官为目的的块茎生长。徐红梅等所做研究只涉及不同激素及其配比对黄精离体繁殖增殖阶段的影响,并无生根、炼苗及移栽的介绍。徐忠传等以黄精根茎段芽端为外植体的繁殖方法虽然包含全过程,但相关数据不具体;比如一个外植体经继代增殖后可得到多少不定芽以及经生根、炼苗、移栽后可得到具体种苗的数量等。而这些数据对黄精种苗生产实现工厂化至关重要。此次试验主要借鉴徐忠传、徐红梅等的经验,对黄精的繁殖从无菌体系到种苗这一过程进行系统研究。所得数据以期直接供生产实践应用,从而促进黄精种苗的工厂化生产。1材料和方法1.1材料表面多花黄精带芽根茎(采自贵州贵阳野生黄精)。1.2方法1.2.1醇冲洗、除硬将黄精根茎从土中挖出,洗去泥土。(1)用刀切取带芽根茎于洗洁精水溶液中浸泡5min,然后用自来水冲洗干净;(2)用75%乙醇擦洗表面,再用自来水冲洗干净;(3)洗洁精水浸泡5min,自来水冲洗60min。(以下步骤在超净工作台中完成)(4)75%乙醇0.5min→灭菌去离子水涮洗两次→2.5%次氯酸钠5min→灭菌去离子水涮洗2次→2.5%次氯酸钠5min→灭菌去离子水涮洗2次→2.5%次氯酸钠5min→灭菌去离子水5次→取出用无菌滤纸吸干水份,用刀切去伤口坏死部分准备接种。1.2.2多元有利条件下的多元分离培养基的筛选将消毒好的黄精带芽块茎接于以MS为基本的培养基,选取不同浓度的6-BA、NAA、2,4-D的外源激素进行配比(表1),从中筛选出最佳不定芽诱导培养基。1.2.3外源激素配比将黄精不定芽接于以MS为基本的培养基,选取不同浓度的6-BA、NAA、2,4-D、GA3的外源激素进行配比(表2),以获得健壮的大量黄精再生苗,并从中筛选出最佳不定芽增殖与壮苗培养基。1.2.4最佳生根培养基的筛选将黄精再生苗接于以MS为基本的培养基,附加不同浓度的6-BA、2,4-D、IBA的外源激素进行配比(表3、表4),从中筛选出最佳生根培养基。以上培养基均附加3%的蔗糖、0.5%琼脂、pH5.8～6.0,在121℃下灭菌20min。培养条件(25±1)℃,1600lx,连续光照12h/d条件下培养。1.2.5基质的接种与栽培将已生根的黄精带芽根茎敞口炼苗3d,然后取出用自来水冲去琼脂,栽种到基质(珍珠岩与蛭石2∶1混合)中。每隔7d施用1次营养液,30d后统计成活率。2结果与分析2.1不同处理工艺的时间后感染由于采用黄精的带芽根茎,不可避免会在其表面附着许多杂菌,采用常规的灭菌方法污染较严重。延长灭菌时间,外植体损伤较重,不利于增殖。实验发现:在冲洗黄精后,用75%的酒精充分擦洗根茎表面;再采取次氯酸钠灭菌3次,每次5min的多次短时灭菌法,污染较少。虽然延长了灭菌时间,但降低了灭菌剂对外植体的损伤。2.2黄精斑块的增殖灭菌后将黄精块茎接于表1的1、2号培养基培养,30d后外植体均明显膨大,获得大量的无菌材料。将膨大的外植体切成0.25cm2小块接于表1中的1～4号培养基,培养30d后统计结果见表1。表1结果显示,4种培养基都能诱导黄精块茎增殖,但只有在含2,4-D的培养基中能在增殖的同时分化出不定芽(见图1);在含NAA培养基中虽有分化但分化率低,而且每块外植体分化出的不定芽极少。所以生长素2,4-D比NAA更适合诱导黄精不定芽的分化,浓度为0.2mg/L的分化率高。2.3黄精的增殖分化将分化有不定芽的块茎切成直径0.5cm大小接于不定芽的增殖与壮苗的培养基培养。45d后统计的生长结果见表2。从表2可知,在5～8号培养基和13～16号培养基中,随着6-BA浓度增加,芽点增殖也增加,但芽越来越小,证明高浓度6-BA有利于黄精的增殖分化。生长势上,添加生长素为2,4-D的培养基中的长势好于添加NAA的培养基。从整体上看,在其它条件相同的情况下,加GA3的培养基比不加GA3的培养基分化增殖明显减少,但是芽长高明显;随着6-BA浓度的增加分化增殖也增加,但不定芽高度有所下降。说明GA3与6-BA相互抑制,同时GA3有使植物长高的作用;但12号培养基分化突然减小,且形成较多粗壮无根苗(图2)。因此,6-BA与GA3之间并不是单纯的抑制作用,而是一个复杂的生理作用过程,其机制尚待进一步研究。另外,从黄精组织块体积增殖水平看,除5、9、13、17号培养基增殖明显少外,其它均在10倍左右。因此,黄精块茎的增殖6-BA的含量应不低于1.0mg/L。2.4-ba和2,4-d的生根将得到的粗壮无根苗(同带芽根茎)单个切下,接于生根培养基中培养,45d后统计的生根结果见表3。从表3可以知道,生根率都不高。其中21、22、23号培养基上的无根苗在整个过程中芽点未长大,且大多枯萎,下端块茎有少量长大,变绿;根是在无根苗基部变绿后从绿色块茎表面长出(图3);在24、25、26号培养基开始时芽点长高长大,30d后才开始枯萎,但枯萎的只是最开始形成的叶片,而长出的地上茎仍然生长良好(图4),在60d后可达到10cm以上。由于在增殖培养基中,60d后外植体能分化出根,并且地上茎也生长旺盛,但根少且细。因此,在生根实验中没有采用徐忠传等人的NAA生根培养基,而是直接采用2,4-D来进行培养基的筛选。由于在24、25、26号培养基中添加了少量6-BA,在长根的同时地上茎也生长,进而在炼苗后直接得到种苗而不是徐忠传等人所报道的只获得生根的根茎,这样就避免了黄精移栽后要经过越冬才能出苗生长的过程。此外,实验中,也用徐忠传等的培养基MS+NAA0.5mg/L用于生根,但生根效果不及2,4-D。这与徐忠传等报道的百分之百生根率不同。推测可能是因为不同地域生长的黄精体内所含内源激素水平不同所致,这有待进一步研究。总之,NAA和2,4-D的生根率都不理想。推测生根率不高的原因可能有两方面。一方面可能是激素的原因,另一方面可能是培养时间不够。从激素方面讲;目前大多组织培养文献都认为IBA生根效果最好,因此,此次试验又将2,4-D换为IBA重新进行生根培养基的筛选,30d后统计实验结果如表4。从表4可以知道,随着IBA浓度增加,黄精无根苗生根率、根长及生根数也随之增加。在IBA浓度达到0.7mg/L时生根率达95%、每个无根苗长出5.2棵根,平均根长2.0cm(图5)。在加入6-BA0.5mg/L培养基中,生根下降,根长及生根数也减少,但无根苗长高,形成的根也较粗壮(图6)。此次生根实验结果表明,IBA比2,4-D、NAA更适合诱导黄