秋水仙素在植物多倍体诱导中的应用

秋水仙素在植物多倍体诱导中的应用

多倍体是指有三个以上完整染色体的生物个体。由于染色体数目加倍,个体外形往往具有巨大性,并且有适应不利自然条件的能力,在生物进化与育种上有重要意义。多倍体往往具有植株粗壮、叶大、花器官增大、花色更娇艳、耐贮藏运输等优点,增加了花卉的观赏价值和商业价值。多倍体植株具有许多优良的特性,而自然界产生多倍体的过程相当漫长,因此人们常用人工诱导的方法获得多倍体植株,分为物理方法和化学方法,物理方法效率太低,不能被广泛利用,因而在多倍体的诱导研究中通常是用化学方法。诱导多倍体的化学药剂很多,主要有秋水仙素、水合三氯乙醛、笑气、富民隆等。被广泛采用且最有效的药剂是秋水仙素,因为秋水仙素的作用只局限于阻碍处于细胞分裂中期的纺锤丝的形成,而对染色体的结构并无显著影响,在遗传上很少发生其他不利的变异。1诱导方法1.1整体植物诱导常用的方法有处理种子、胚根和生长点。1.1.1金鱼草种子染色体变异类型设计用秋水仙素溶液直接浸泡种子,此方法简便易行,但加倍功效较低,且容易产生嵌合体。用秋水仙素溶液处理金鱼草种子,镜检发现变异植株的染色体多为嵌合体;用秋水仙素处理虞美人种子,产生多种变异类型,有四倍体、八倍体及嵌合体;用秋水仙素处理新疆雪莲种子,变异植株全部为嵌合体,生长后期,绝大部分嵌合体由于根部畸形,无法吸收营养,最终死亡,存活下来的少量嵌合体幼苗在不同程度上发生了回复突变。1.1.2不同植物种类对秋水仙素的应用应注意使用的单种子萌发后,用秋水仙素溶液浸泡种子胚根,该方法对材料有一定的伤害,不同植物种类对秋水仙素的敏感度不同。应用时应注意浓度和处理时间的选择。用秋水仙素处理发芽1~2cm的枸杞种子,50%的植株具变异性状,但大部分生长缓慢,最后死亡,四倍体只占6.7%。1.1.3秋水仙素对枸杞幼苗生长的诱变效果常用脱脂棉包裹幼芽,每日滴秋水仙素溶液,连续处理或间歇处理数日,或将生长点浸泡在秋水仙素溶液中。与处理种子、胚根相比,处理更加直接,同时对材料的伤害较轻,诱变效果较好。以用浓度为0.5%的秋水仙素处理枸杞小苗的生长点,连续处理72h或间歇处理36h,诱变率达27%,成苗的四倍体占13%和20%,与处理胚根法相比诱变效果显著。将荷花种子破壳催芽,待第二叶开始长出后选择长势一致、生长正常的种苗,用脱脂棉包裹幼芽,每天滴0.05%秋水仙素溶液3~4次,处理96h,加倍效果不理想;但将荷花种子及芽全部浸泡在0.05%秋水仙素溶液中48h和72h,均获得了良好的加倍效果。此外,将秋水仙素直接注射到郁金香花苞中下部的子房位置,也获得了多倍体。1.2诱导分化成苗在无菌条件下用经过滤灭菌的秋水仙素溶液浸泡离体植物组织,处理结束后用无菌水漂洗数次转入培养基中培养,或将外离体植物组织接种到添加了秋水仙素的培养基内进行诱导培养,一段时间后,再转入不含秋水仙素的培养基中,使其分化成苗。离体的植物组织包括小苗、茎段、丛生芽、愈伤组织、叶片等任何可分化成苗的器官及组织。1.2.1秋水仙素处理浸泡处理是秋水仙素对外植体作用最为直接的一种,材料的生长和分化在不同程度上受到抑制,甚至部分死亡。筛选适宜的处理浓度、时间组合是多倍体诱导的关键。以0.2%秋水仙素溶液处理番木瓜无菌苗72h效果好,诱导率最高达36.7%。将香石竹带芽茎段浸泡在0.05%的秋水仙素溶液中50h,变异率达21.0%。用0.2%秋水仙素溶液浸泡花叶绿萝丛生芽24h,诱变率达14.0%。将彩色马蹄莲的愈伤组织在0.05%秋水仙素溶液中浸泡24h,转入分化培养基,诱导率最高达52.0%。叶片也可作为多倍体的诱导材料,取鄂柿的无菌叶片,沿中脉横切成3~4块,随即放至0.5%的秋水仙素溶液中,在黑暗条件下振荡处理96h,随即转入分化培养基,诱导获得十二倍体再生植株。1.2.2大岩桐叶片诱导变/根用秋水仙素液体浸泡处理对外植体的伤害较直接,多次冲洗增加了外植体受污染的机会,秋水仙素加入培养基法避免了外植体的直接伤害,冲洗次数降低,也降低了受污染的几率,所以日益受到科学工作者的青睐。将大岩桐叶片接种到20mg·L-1秋水仙素的培养基中培养1周,诱变率达62.5%,诱变效果优于浸泡处理。将红千层茎段接入含0.2%秋水仙素的培养基中培养15d和20d诱变效果最佳,达10.0%。用含有0.05%秋水仙素的液体培养基培养红果冬青的丛生芽48h,变异率最高,达40.0%。2秋水仙素对多倍体的诱变效果秋水仙素的浓度是诱导多倍体的成败关键之一,浓度过低,不能产生加倍效应,浓度过高则抑制植物材料生长甚至死亡,处理的浓度、时间因不同植物和同一植物的不同组织而异。在一定范围内,秋水仙素浓度与处理时间同诱变效果呈正相关,同植物材料存活率呈负相关。光照情况是影响多倍体诱导效果的第二显著因素,试验探索得到,无光条件更利于多倍体诱导。温度影响药剂的水解速度,低温条件下药效减弱,高温条件下药效增强但对植物组织的损伤较大,变温处理可提高诱导效果同时减轻对植物的伤害。渗透剂二甲基亚砜(DMSO)能促进秋水仙素快速浸透到植物组织中,能减轻秋水仙素的药害作用,显著提高秋水仙素的加倍效果并降低嵌合体的发生率,在作物的多倍体研究中得到了验证。此外,植物的不同组织、诱导方法及诱导前的状态对诱导率也有影响。2.1不同浓度秋水仙素前处理对桉树多倍体诱导效果的影响用秋水仙素溶液浸泡百合的鳞片、无菌试管苗、不定芽、丛生芽,均获得了多倍体,浓度为0.02%~0.10%,诱变率在13.3%~50.0%,处理不定芽的诱导效果最佳,诱变率达50.0%。用秋水仙素溶液处理桔梗的愈伤组织,浓度为0.2%、处理时间为15h诱变效果最佳,但诱导率也不过为20.0%;用0.1%的秋水仙素处理其带芽茎段40h,诱导率达50.0%。用0.05%秋水仙素溶液浸泡处理小叶绿萝的不定芽72h,不定芽无死亡现象发生,诱导率达12.5%;而浸泡愈伤组织72h,死亡率可高达90.0%,且诱导完全不成功。用0.5%秋水仙素处理桉树的单芽和丛生芽进行多倍体诱导,处理单芽120h时诱变率最高,达42.9%,死亡率也最高,达65.0%;处理丛生芽96h时诱变率最高,达38.5%,死亡率35.0%。丛生芽的诱导效果比单芽好。与茎段、叶柄相比较,叶片是毛泡桐和白花泡桐四倍体诱导的最佳材料,经秋水仙素处理后叶片最高存活率略低,但四倍体诱导率明显高于茎段和叶柄。以库拉索芦荟的丛生芽、微块茎、愈伤组织为材料,用秋水仙素浓度为0.05%的固体培养基培养24h,愈伤组织诱变的效果最差;丛生芽诱导效果较理想。2.2诱导方法2.2.1诱导率及诱导效果在培养基中添加一定浓度的秋水仙素,或者用秋水仙素浸泡处理植物材料一段时间再转入培养基中培养,均可诱发多倍体的产生,不同植物种类的最佳诱导方法存在差异。用0.1%的秋水仙素处理贝母的愈伤组织24h,诱导率为47.0%;将其接种到含1000mg·L-1秋水仙素的培养基中处理5d,诱导率最高达70.0%,诱变效果优于浸泡处理。以不定芽为材料对金银花进行多倍体的诱导,将其接种到添加秋水仙素的培养基上培养1个月,以添加40mg·L-1秋水仙素处理组诱导率最高,为20.0%;用0.2%秋水仙素浸泡不定芽72h的诱导率仅15.0%。以种子为材料进行杜仲多倍体的诱导,研究表明,用秋水仙素处理后再进行试管萌发处理,其多倍体的诱导率高于培养基中添加秋水仙素直接进行试管萌发的处理。2.2.2倍体诱导率测定u将红掌愈伤组织放入含200mg·L-1秋水仙素的液体培养基中振荡培养14d,诱导率为45.45%,高于固体培养基处理的四倍体诱导率。在毛泡桐和白花泡桐四倍体诱导研究中,双层培养基的诱导效果最好。剪秋罗的茎段接入含400mg·L-1秋水仙素的培养基培养,液体培养基比固体培养基诱导率和存活率高。2.3预处理的时间对诱导效果的影响由于秋水仙素见光易分解,诱导处理需在黑暗环境进行,诱导前将材料置入黑暗环境进行预处理的时间对诱导效果有一定的影响。在毛泡桐和白花泡桐四倍体诱导研究中,外植体的预培养时间对外植体存活率、芽诱导率和四倍体诱导率的影响皆达到极显著水平。将茶树幼苗先遮光黄化3d后再用秋水仙素处理生长点效果较好。3多倍体测试3.1外部形态的变化最简单、最直观粗放的鉴定方法,主要是观察株高、茎粗、叶色及厚度、花冠、花药及花粉、果实、种子等外部形态的变化。由于秋水仙素处理后会引起生长初期的表型畸变,所以在早期用形态特征指标来鉴定多倍体是不可靠的。3.2整倍性的鉴定最直接、也是最准确的鉴定方法。它不但能区分倍性而且还能鉴定是整倍性或非整倍性的变异。但技术性要求高,工作量大,而且实现的可能因植物而异。3.3气孔大小和密度气孔的大小、密度,保卫细胞的长度、宽度及叶绿体的数目可作为多倍体鉴定的间接指标。气孔的大小与倍性呈正相关,气孔的密度与倍性呈负相关。以气孔为指标间接鉴定杜仲多倍体,与通过染色体记数法直接鉴定相比,其误差不超过25%。认为利用气孔大小和密度来鉴定杜仲多倍体是一种相对可靠的方法。还可以作为鉴别渥丹百合多倍体、红掌四倍体的可靠方法。如在同一植株或同一表皮上的气孔大小差异明显,此植株多为嵌合体,必须通过再次脱分化诱导不定芽的方法分离获得纯多倍体植株。3.4克氏原螯虾多倍体的鉴定流式细胞术可以直接测定细胞核的DNA含量,测量精确、快速、重复性好,通过比较细胞核DNA含量来鉴定倍性较准确,这种方法已被成功地用于苹果、草莓、白花泡桐、美人梅、剪秋罗的倍性鉴别上。此外,李涵等用指纹图谱分析法对齿瓣石斛多倍体进行分析,研究表明正常二倍体与多倍体齿之间存在着明显的差异,推断在多倍体诱导过程中,存在着较多的加倍类型或少数染色体结构的变异。王鸿鹤等对重瓣大岩桐多倍体进行了过氧化物同工酶酶谱分析比较,但酶谱带数与倍性之间无相关性,不能作为倍性进行鉴定的指标。李政等对绿玉树不同倍性的植株进行共有谱带、特有谱带的比较,研究发现,二倍体绿玉树的过氧化物酶同工酶谱带仅有5条,而四倍体谱带有8条,其中3条明显加强,仅能说明四倍体绿玉树的过氧化物酶同工酶活性增强。4问题和视角的取消4.1其他植物对秋水仙素的抗性秋水仙素的作用机理在于它能抑制或妨碍细胞的纺锤丝形成,使分裂的染色体停留在赤道板,不向两极移动,而细胞质不分裂,导致染色体数目增加。秋水仙素对外植体有毒害作用,常常使材料的生长受到抑制或死亡。不同植物对秋水仙素的敏感程度不同,除处理浓度外还有多种因素共同影响诱导效果,综合使用各方法可提高材料成活率和诱导率;不同植物或同一植物的不同部位也有差异,各种植物的诱导系统有待完善。4.2染色体计数的有效方法染色体记数法是最直接、最准确的鉴定方法,但技术性高,工作量大,对材料的状态要求严格,只有处于旺盛分裂期的组织才能用于染色体计数,实现的可能因植物而异。因此,找到一种简单、快速、相对可靠的间接方法势在必行。流式细胞术可以直接测