铁皮石斛资源保护与开发利用

铁皮石斛资源保护与开发利用

0发酵铁皮石斛石斛是世界上的第二面兰花。它是一种多年生草本植物，有1500多种药物作用。最著名的是剥皮石、金针石、霍山石等。铁皮石斛是近年来最受欢迎的药用石斛种类之一,其研究和生产受到广泛的关注,主要分布于广东、广西、云南、贵州、浙江等地。大多生长在炎热潮湿的热带、亚热带的岩石缝隙、悬崖峭壁间,繁殖率很低,在自然野生状态下只有10%~17%。种子较小,胚胎少胚乳,发芽率低于5%,在自然条件下须与兰菌共生才能萌发。因此无法在大田或苗床上播种,很难生产足够的实生苗用于栽培。铁皮石斛对生长环境要求苛刻,成苗更困难。传统的分株和扦插等人工繁殖方法,增殖速度非常低。由于铁皮石斛的生长、繁殖特性以及人类长期无节制的采挖、破坏,导致其野生资源越发稀缺。目前铁皮石斛已被列为国家重点保护药用植物、中国珍稀濒危二级保护植物和世界二类保护植物。从20世纪70年代起,国内外已经开始铁皮石斛组织快繁技术的研究,尤其是在组织培养与快速繁殖技术、人工栽培技术等方面。铁皮石斛在组织培养中有3个关键时期:原球茎的诱导、原球茎的增殖、壮苗生根的培养。结合国内外相关研究进展,本研究就近年来铁皮石斛组培快繁技术的研究现状进行了综述,包括外植体的选择,不同培养基、激素、添加物对组培过程中的影响,以及壮苗生根的方法等,以期为实现铁皮石斛的产业化生产提供理论依据。1发酵时间的测定种子、原球茎、无菌幼苗茎段、叶片和根是目前铁皮石斛主要的外植体材料。其中由种胚形成的原球茎质量较好,而由种子诱导形成的愈伤组织分化能力较强。2最适温度和光照参数铁皮石斛的生长主要受光照和温度等因素的影响,在12h/d为光照周期下,原球茎的生长最适温度为(25±1)℃,而形成健壮的试管苗则需要较低的温度(23℃);在光照强度为1500lx下,铁皮石斛生长的最适温度为25℃。鲍顺淑等研究表明,最适合铁皮石斛组培苗生长发育的光照周期为12h/d,此时植物的叶绿素含量和净光合速率较高,生长与繁殖能力较强。3种子萌发3.1培养基组成对萌发的影响种子自然成熟大概需要230天,种胚无菌播种时的萌发率,一般能达到90%以上。大量研究表明,成熟种子在1/2MS、MS、PT、N6、SH、KS、VW等基本培养基上均能萌发,但种子萌发效果各有不同,另外,培养基的养分含量也直接影响萌发质量。罗吉凤等研究发现,经过30天种子萌发,MS、1/2MS、1/2N6和White培养基的种子发芽率均达到了95%,种子萌发效果较好,同时李书心研究结果也表明了种子培养的基础培养基以1/2MS为最好。在赵天榜等对减半培养基研究结果表明,14种培养基中,几乎所有基本培养基的种胚成苗率均优于其减半培养基,N6最好,MS、SH、Kn次之,减半培养基中最差的是1/2MS、1/2VW。D.fimbriatum种子在Nitch、VW上培养基上萌发率高达91%,MS(85%)次之,而且不同种类的铁皮石斛对培养基的要求不相同。3.2kt、iaa对种胚萌发的影响不同种类的激素对种子萌发具有促进和抑制作用,不同浓度的激素对种子萌发同样具有重要影响。基础培养基中加入一定浓度的NAA促进萌发,而加入6-BA则对种胚萌发后的生长起抑制作用,加入KT、IAA且浓度大于1mg/L时,其对胚萌发和成苗起抑制作用。众所周知,ABA具有抑制种子萌发及植物生长作用,而张铭等和郑志仁等的研究发现在基础培养基中添加0.15mg/LABA能显著提高铁皮石斛原球茎的质量,也完善了对ABA功能的认识。3.3植物提取物的萌发率有研究表明,不同种类的天然添加物对种子萌发影响一样显著,曾宋君等提取香蕉、椰子、马铃薯和豆芽等植物提取物,加入基础培养基后,研究结果发现种子萌发率可高达90%以上,而添加蕃茄提取物的培养基仅有65%的种子萌发率。早期也有研究认为椰乳和香蕉等提取物会不利于种子萌发和正常发育。3.4片糖、红糖和蔗糖对胚萌发和成苗的影响碳源在组织培养中主要具有促进作用,研究人员在改良的N6+0.2mg/LNAA培养基上,比较了片糖、白糖和蔗糖对胚萌发和成苗的影响,发现片糖和白糖为炭源的效果较好,该碳源中特有的矿质元素可能是对胚萌发和成苗具有显著的促进作用。另外,在培养基中适当加入活性炭,吸附代谢过程中的废弃物,可以有效预防组织褐变,客观上促进胚胎发生与生根。4株原生殖器4.1培养基的基本培养基目前,1/2MS、MS培养基也是铁皮石斛原球茎增殖实验中主要应用的基本培养基。唐桂香等选取6种不同培养基,研究铁皮石斛原球茎增殖效果,发现在1/2MS培养基中生长的原球茎无分化、体积大,是原球茎增殖效果最好的基础培养基。4.2培养基中bae大量实验表明,适宜的KT、NAA、6-BA浓度对原球茎的增殖起促进作用。培养基1/2MS+1.0mg/LBA+0.1mg/LNAA有利于原球茎诱导增殖,改良的MS液体培养基中加入0.5mg/LABA对原球茎的鲜重和干重都比对照明显增加,培养基1/2MS+3.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA或1/2MS+2.0mg/LBA+0.15mg/LNAA,原球茎的增殖系数较大。在培养基中加入1.0mg/LNAA+0.2mg/LKT比较适合原球茎的增殖,添加1.1mg/LNAA+1.1mg/L6-BA+1.1mg/LKT有利于原球茎的增殖。王光远等使用D.candium种子进行离体培养,在MS上添加0.5mg/LNAA,暗培养1周后形成大量愈伤组织,转入光培养后形成大量原球茎。4.3马铃薯汁、椰子汁、苹果汁对马铃薯汁的促进作用天然附加物对铁皮石斛增殖的影响差异很大,马铃薯汁、椰子汁、苹果汁促进作用效果较好,其中椰子汁的效果优于马铃薯泥和香蕉泥。而香蕉汁却抑制增殖或导致原球茎生长不良。4.4蔗糖对原球茎生长的影响与种子萌发过程不同,碳源在铁皮石斛原球茎增殖过程中的影响效果不一,研究人员用果糖、蔗糖和葡萄糖分别作为碳源作用于原球茎增殖培养,结果蔗糖明显优于其他2种碳源。何铁光等则进一步的深入研究发现蔗糖浓度为30g/L时促进原球茎生长;蔗糖浓度为30~60g/L时,原球茎生长随着浓度的增加,抑制作用越大,生长周期越延长;蔗糖浓度大于60g/L时,原球茎生长受到明显的抑制。5原文5.1/2msw、n6基本培养基MS、1/2MS等用作基本培养基在原球茎分化培养时比较常用。张治国等的研究也有类似结果并得到1/2MS培养基要比VW、N6等其他5种基本培养基最适宜原球茎的分化,分化苗生长整齐且叶片浓绿,另有大量研究都证明了铁皮石斛丛生芽在1/2MS培养基上生根效果最好。5.2ba+2.4.4gnaa对原球茎生长和增殖的影响培养基中添加BA和NAA后可促进原球茎的分化[5,22,28,29,30,33]。不同浓度及组合的BA与NAA对原球茎生长影响效果显著,培养40天后,添加2.0mg/LBA+0.2mg/LNAA可促进原球茎的分化和增殖的;培养60天后,以0.2mg/LBA+2.0mg/LNAA组合较好,小苗生长发育快。在MS培养基中加入3.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA+1.0mg/LKT,在45天后原球茎分化率达到84%。蒋波等在1/2MS基本培养基中添加2.0mg/LBA+0.2mg/LNAA或3.0mg/LBA+0.2mg/LNAA,有利于原球茎的分化。5.3不同作用马铃薯提取液对原球茎分化的影响土豆汁、马铃薯提取液和香蕉汁用作添加物对原球茎的分化有不同的作用,实验表明,土豆汁和马铃薯提取液均可促进分化,20%马铃薯提取液培养基中原球茎分化率最高,分化苗较健壮整齐。而香蕉汁对原球茎的分化有明显的抑制作用。5.4蔗糖对原球茎分化的影响活性炭对原球茎的分化在适当的浓度范围内能起到促进作用。有研究表明蔗糖浓度的高低对原球茎分化的影响显著,当蔗糖浓度为2%时是原球茎分化最适合浓度,分化率可达100%,而随着蔗糖浓度的升高分化率明显降低,当蔗糖浓度大于3%时,原球茎将不再分化,且增殖率也随着蔗糖浓度的增高明显降低,可能由于培养基的渗透压过高而抑制了原球茎的分化和生长。6生根和壮苗6.1对植物生长的影响目前,生根壮苗较常用的基本培养基有1/2MS、MS、B5、N6等。刘骅等研究认为1/2MS和B5培养基最适合铁皮石斛试管苗壮苗,张玲等比较了4种培养基MS、N6、B5、KC对幼苗生根壮苗的影响,N6效果较好,B5次之。赵天榜等研究了14种培养基对铁皮石斛组培苗生长的影响,效果依次为N6>SH>MS>1/2MS>1/2VW。6.2各组苗的生长情况在培养基中加入NAA、IAA、IBA等激素对试管苗生根壮苗有促进作用。在MS培养基上添加NAA,IAA和IBA后,对幼苗生长均有促进作用,均比各自对照组的苗更粗壮,根系更发达;总体来说,NAA效果好于IAA和IBA。另有研究,激素浓度在幼苗生长过程中的影响,在1/2N6培养基中添加1.0~2.0mg/LNAA,可提高石斛种胚苗分蘖率6.00~7.14倍,1.0mg/LNAA诱导铁皮石斛生根效果最明显,而0.5mg/LNAA在生根过程中效果最好,类似结果在王春等研究中也有表明,铁皮石斛不定芽最佳生根培养基为1/2MS+0.5mg/LNAA,生根率达到100%,平均生根数为7.1条。6.3皮石斛幼苗根系发育的作用有大量的研究表明,在基本培养基中加入天然添加物,对铁皮石斛幼苗根系的发育有促进作用,香蕉汁、苹果汁、马铃薯汁、椰子汁、荸荠汁、绿豆芽汁等均能起到促进作用,其中香蕉汁的作用最为显著[11,12,16,29,27,36]。6.4食用红糖中含有总微量元素的方法有研究表明,培养基中添加的食用白糖比蔗糖在试管苗生长根时有明显促进作用,根数和根长上更具优势,食用白糖中含有各种微量元素可能是主要原因。另外,生根培养时加入活性炭有助于试管苗的生长,能促使根系长得更粗壮,而唐桂香等的研究表明培养基中添加活性炭对苗的根数和根长影响不明显。7松树皮、相皮的栽植与保湿由于温度和光照等主要生长条件发生变化,移栽之前需要经过1周炼苗。移栽时避免伤及幼嫩组织,洗净附着在根部的培养基。培养基质应疏松透气,最好经过灭菌,移栽铁皮石斛一般需要碎石和基质,如1/2花生壳(发酵过)+1/2碎石、1/2松树皮(发酵过)+1/2碎石等,碎石也可用珍珠岩等代替,发酵过的基质还可以选择泥炭或锯末,再覆以苔藓类,移栽成活率可达到95%以上。移栽时最适温度是15~30℃,气温过低或过高均不适宜出瓶移栽,一般来说,除了1—2月和7—8月外均可栽培,部分高海拔地区,12月至次年3月外的时间可达到移栽的合适温度。移栽成功的1周后适量浇水,15天后每周施1次叶面肥以促进根部生长,先长根再长芽,可选“花宝5号”或“花多多”稀释3000倍后均匀喷洒。通过田间试验发现,温控好、通风及光照号的大棚,组培苗生长迅速、粗壮,再配以良好的生长基质和良好的水肥配给,半年后的成活率可达95%,并具有新萌发的幼苗,而简易大棚则生长缓慢,一般低于50%,且生长缓慢。8对皮石斛组培快繁技术应用于规模化育苗栽培的初步总结铁皮石斛多生长于树皮或岩石上,开花多结果少,自然条件下发芽率一般低于5%。由于铁皮石斛自然条件下繁殖率低,因此运用组织培养技术进行组培苗的繁育,对于保护该物种起到积极的作用。铁皮石斛在种苗的组织培养方面已经取得很大的进步,但仍存在一些问题。从目前的研究进展来看,铁皮石斛组培快繁技术应用于规模化育苗栽培还需解决以下几个问题:第一,组培苗的生产成本高。铁皮石斛组培苗快繁时,培养转接次数多,周期长,消耗了大量的人力和物力。第二,移栽苗的成活率低。解决该问题应从以下几个方面入手:(1)试管苗的大田移栽是铁皮石斛快繁技术实现产业化的瓶颈。需要从各方面