猪卵母细胞冷冻保护剂毒性试验

猪卵母细胞冷冻保护剂毒性试验

减少对猪卵细胞的冷冻保护，提高卵母细胞在冷冻后的发育潜力，对基础研究和生产应用具有重要意义。近年来,猪卵母细胞冷冻取得了一些进展,但其冻后发育潜能依然很低。Fujihira等报道,玻璃化冷冻猪未成熟(GV期)卵母细胞,解冻后体外成熟并进行胞浆内单精注射(ICSI),结果获得13.5%的囊胚发育率。Rojas等报道,猪体外成熟(MⅡ期)卵母细胞经玻璃化冷冻后再行体外受精(IVF),其卵裂率为10.4%。从总体上看,猪卵母细胞的冷冻保存现阶段仍主要集中于对冷冻液、冷冻载体、冷冻-解冻程序和采用去脂处理等方面的研究上,以期提高冷冻保存效果。本试验旨在研究多种冷冻保存方案对猪卵母细胞冻后发育能力的影响,以期建立有效的冷冻保存猪卵母细胞的操作程序,为地方优良猪种的资源保存建立技术平台。1材料和方法1.1卵丘-卵母细胞的采集从南京市哈慈天环食品有限公司下属屠宰场采集猪卵巢,置于37～39℃生理盐水(含青、链霉素各500IU/mL)中,2h内送达实验室。用添加1%新生牛血清(NCS)的杜氏磷酸盐缓冲液(PBS)洗卵巢3～4次,采用抽吸法采集卵巢表面Φ2～5mm卵泡卵母细胞,实体显微镜下捡取胞质均匀、包被3层及其以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体(COC);采集的COC用培养液洗2～3次备用。捡卵后留下的猪卵泡液(Porcinefollicularfluid,pFF)收集于10mL离心管中,以1500r/min离心5min,收集上清液,以0.22μm滤器过滤后分装保存于-20℃备用。1.2基础培养液制备基础培养液为TCM199,添加10%NCS、0.36mg/L丙酮酸钠、1mL/L乳酸钠、70mg/L青霉素和50mg/L链霉素。成熟培养液是在基础培养液中,另添加10%pFF、10IU/mL孕马血清促性腺激素(PMSG)、10IU/mL人绒毛膜促性腺激素(hCG)、69μg/mLL-半胱氨酸和1μg/mL17β-雌二醇(E2)。卵母细胞于成熟培养液中培养24h后,再转入基础培养液中继续培养20h。培养条件为38.5℃、5%CO2和饱和湿度。经培养后,卵母细胞排出第一极体(pbI)或卵丘扩散至卵母细胞直径5倍以上者判为成熟。1.3评估蔗糖全球培养用本实验室所建立的OPS法冷冻猪GV期和MⅡ期卵母细胞,方法是卵母细胞先在20%乙二醇(EG)TCM199冷冻液中平衡5min,转入40%EG+0.5mol/L蔗糖TCM199冷冻液(停留时间不超过30s)中装入OPS管,每管装5枚卵母细胞和约2μL玻璃化冷冻液。装管后立即投入-196℃液氮中冷冻保存。解冻时,从液氮取出OPS管直接放入37℃0.5mol/L蔗糖溶液中,回收卵母细胞;平衡5min后,将回收的卵母细胞转入0.25mol/L蔗糖溶液再平衡5min,然后用TCM199培养液洗2～3次备用。1.4冷冷冻卵母细胞的测定1.4.1正常形态者所占的百分率形态正常率是指卵母细胞经冷冻-解冻后,保持正常形态者所占的百分率。解冻后形态正常的卵母细胞基本保持冻前的形态特征,细胞无碎裂,卵丘无脱落,卵母细胞胞质饱满、均一,透明带完整。1.4.2荧光显微镜检查解冻的卵母细胞置于5μg/mLFDA(SIGMA)染液中,于38.5℃孵育3min,用TCM199洗2～3次后,置于荧光显微镜下检查。发强荧光者判为存活卵母细胞,不发荧光或荧光微弱者判为死亡;以发强荧光者所占的百分率计算冻后卵母细胞的存活率。1.5猪卵母细胞的体外受精ivf和胚胎培养1.5.1去除卵丘细胞培养44h后,将卵母细胞转入0.1%透明质酸酶中,38.5℃孵育15min,微吸管吹打去除卵丘细胞。挑选胞质饱满均匀、排出pbI的卵母细胞,分别用TCM199培养液和获能液(mTBM)洗2～3次,移入上覆石蜡油并在CO2培养箱中过夜平衡的mTBM微滴(50μL)中,每滴置卵母细胞15～20枚,放入CO2培养箱中,等待受精。1.5.2悬浮精子的提取用37℃平衡0.5h的精子清洗液(DPBS)与mTBM液对精子进行处理。取1mLDPBS加入盛有1mL新鲜精液的离心管中离心(3000r/min,5min)、弃上清;再加入2mL的DPBS,吹打悬浮精子后再离心、弃上清,加入2mLmTBM,悬浮精子沉淀。离心弃上清后,用含有肝素(100μg/mL)的mTBM调节精子浓度至1.0×106个/mL,备用。1.5.3体外经济取50μL备用精子,加入等待受精的卵母细胞微滴中,于38.5℃、5%CO2气相、饱和湿度条件下共同孵育6～8h。1.5.4完善粗胞培养方法精卵共同孵育6～8h后,转入预平衡的NCSU-23培养液中洗3～4次,每10～15枚假定受精卵置于100μLNCSU-23微滴中,于38.5℃、5%CO2气相、饱和湿度的CO2培养箱中培养。1.6试验组1.6.1体外受精和fpss检测GV期和MⅡ期卵母细胞不作冷冻,只经冷冻前后的处理程序,研究室温条件下本试验所用冷冻液的毒性作用及其对卵母细胞发育能力的影响。其中GV期卵母细胞对照组直接采用GV期卵母细胞进行体外成熟培养、体外受精和FDA染色,不接触冷冻液。GV期卵母细胞处理组是将卵母细胞先置入20%EGTCM199液5min,再转入40%EG+0.5mol/L蔗糖TCM199液30s,最后分别于0.5mol/L蔗糖和0.25mol/L蔗糖TCM199液中各处理5min,以10%NCSTCM199洗2～3次后,进行体外成熟、体外受精和FDA染色。MⅡ期卵母细胞来源于GV期卵母细胞的体外成熟,其对照组是将卵母细胞直接用于体外受精和FDA染色;处理组使用冷冻保护剂的处理方法同GV期卵母细胞处理组,处理后直接进行体外受精和FDA染色。1.6.2体外成熟、外受精与胚胎培养按“1.4”进行猪卵母细胞的冷冻和解冻,试验设计成3组:I组为对照组,GV期卵母细胞不作任何处理,直接进行体外成熟、FDA染色、体外受精与胚胎培养;II组为GV期卵母细胞冷冻组,经冷冻-解冻后,进行体外成熟、FDA染色、体外受精与胚胎培养;III组为MⅡ期卵母细胞冷冻组,该组卵母细胞来源于GV期卵母细胞的体外成熟,经冷冻-解冻后,作FDA染色、体外受精与胚胎培养。1.7处理数据试验数据采用SPSS软件进行差异显著性分析。2结果与分析2.1体外受精胚卵裂率GV期与MⅡ卵母细胞分组处理后,其FDA染色存活率、体外成熟率和体外受精胚卵裂率见表1。表1显示,经历冷冻保护剂处理后,GV期卵母细胞存活率、体外成熟率及体外受精胚卵裂率虽略低于对照组(85.9%,72.4%和50.9%对91.3%,73.9%和53.3%),但两组间无统计学差异(P>0.05);试验组MⅡ期卵母细胞存活率虽显著低于其对照组(84.2%对92.6%,P<0.05),但其体外受精胚卵裂率则与对照组间差异不显著(P>0.05);GV期与MⅡ期卵母细胞相比,两者经冷冻保护剂处理后,其存活率、体外受精胚卵裂率均无显著差异(P>0.05)。2.2不同发育时期卵母细胞的体外成熟率和卵裂率猪GV期和MⅡ期卵母细胞经玻璃化冷冻-解冻后,抽检其冻后形态正常率、FDA染色存活率、体外成熟率与卵裂率,结果见表2。表2表明,经OPS法玻璃化冷冻后,GV期和MⅡ期卵母细胞均获得较高的形态正常率(92.4%对94.2%,P>0.05),但GV期卵母细胞冻后存活率要显著高于MⅡ期卵母细胞(56.8%对41.9%,P<0.05)。经玻璃化冷冻后,GV期卵母细胞的体外成熟率和卵裂率都比新鲜卵母细胞要显著下降(42.6%和7.79%对73.9%和53.3%,P<0.05),而MⅡ期卵母细胞冷冻-解冻后经体外受精,未获得卵裂。在GV期卵母细胞冷冻组,154枚卵母细胞冻后经体外成熟、体外受精及体外培养,共有12枚发生卵裂,其中6枚发育至8-细胞,3枚发育至16-细胞,3枚发育至桑椹胚。3讨论3.1不同冷冻保护剂对gv期卵母细胞的影响冷冻保护剂可以保护细胞免受冷冻伤害,合理选择冷冻保护剂对卵母细胞的冷冻至关重要。有关猪卵母细胞冷冻保存的报道相对较少、冷冻效率偏低,多数研究集中于冷冻剂种类与使用浓度上。Huang等以细胞毒性实验来研究甘油、二甲亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、1,2-丙二醇(PROH)4种常用的冷冻保护剂对猪卵母细胞的影响。结果显示,无论在室温或10℃,甘油做冷冻保护剂时GV期卵母细胞的存活率要低于其他组;在10℃,EG做冷冻保护剂时MⅡ期卵母细胞的存活率要高于其他3组(40%对23%～26%,P<0.05)。这说明在猪卵母细胞冷冻上,各种冷冻保护剂均具有保护作用,但效果不一样,甘油的效果较差,EG相对较好。在冷冻保存研究中,EG常被用作渗透性冷冻保护剂、蔗糖为非渗透性冷冻保护剂。因此,本试验选择EG和蔗糖组成玻璃化冷冻液,以期在保证冷冻保护效果的同时,最大限度地减少冷冻保护剂对卵母细胞的毒性作用。冷冻液的化学毒性不仅与其种类有关,而且与其所用浓度和处理时间有关。当卵母细胞转入冷冻液时,随着时间的延长和浓度的不同,会影响到细胞膜的通透性与细胞超微结构变化,甚至会改变生物大分子的结构与功能,最终使卵母细胞发育能力受损。本研究以卵母细胞存活率、体外成熟率和体外受精胚卵裂率及其后续的发育为受试指标,试验表明,所用冷冻液与处理程序无论对GV期还是对MⅡ期卵母细胞,并不构成明显的毒性作用,可用于卵母细胞冷冻保存研究。3.2不同成熟时间的卵母细胞在不同冷冻保存的的影响目前,国内外许多研究集中于不同时期卵母细胞的冷冻保存,但哪一时期卵母细胞的冷冻效果更好?仍颇有争议。MⅡ期卵母细胞的纺锤体对低温耐受性很低,冻后卵母细胞纺锤体的恢复能力与其损伤程度、解冻后培养温度和培养时间有关。而成熟卵母细胞的纺锤体对于体外受精、第二极体排出和原核迁移都是十分重要的。一旦纺锤体解聚,则会导致染色体分离,体外受精失败,发育终止。人卵母细胞在室温放置30min,纺锤体就完全解聚,复温后仅25%～50%可恢复纺锤体结构。牛体外成熟卵母细胞在4℃保持10～20min,纺锤体可完全解聚,而猪卵母细胞在4℃仅5min,就会发生部分或完全解聚。在未成熟(GV期)卵母细胞,染色体存在于核内,不存在成熟纺锤体结构。GV期和MII期卵母细胞的这一差异,或许可以解释本研究中GV期卵母细胞比MⅡ期要具有更大的耐冻性。试验中GV期卵母细胞经玻璃化冷冻后,再经体外成熟、体外受精,获得7.79%的卵裂率,而MⅡ期则未获得卵裂。这一结果显著低于新鲜卵母细胞的卵裂与发育,表