铁皮石斛组培快繁技术研究

铁皮石斛组培快繁技术研究

西林石斛是多年生蕨类植物，也被称为黑节草。这是一种珍贵的药物，以其表皮为绿色而闻名。自古以来铁皮石斛就被认为是滋阴补益的珍品。唐开元年间道家经典著作《道藏》中将其列为中华九大仙草之首。在《神农本草经》、《本草纲目》、《现代中药大辞典》中均有记载,《中华人民共和国药典》2010年版将铁皮石斛从石斛中分出作为单一品种收载。近几年来,铁皮石斛在用于癌症放疗、化疗后的副作用消除和体能恢复等临床效果显著。铁皮石斛生长在高山峻岭悬崖峭壁和岩石缝隙或深山古树上,在野生状态下,繁殖速率低下、生长缓慢。铁皮石斛资源紧缺、用量大,加之其具有极高的药用与经济价值,已被列为国家重点二级保护植物。为了保护这一珍贵的野生兰科植物资源,需要扩大铁皮石斛人工种植的规模。本文结合铁皮石斛的生物学特性,利用组织培养技术,开展研究铁皮石斛组培快繁技术,以期为铁皮石斛的大规模人工种植提供技术支撑。1材料和方法1.1材料表面1.1.1竹材的栽培品种本实验用的铁皮石斛采自湖南省新宁峎山上,采回后栽种在湖南省长沙县实验园地。采回的铁皮石斛由河南信阳师范学院植物研究所鉴定为野生铁皮石斛。1.1.2材料、设备和测试设备MS培养基(MurashigeandSkoog固体培养基):上海艾研生物科技有限公司生产;BA(6-苄基腺嘌呤):上海锐聪实验室设备有限公司;I-BA(吲哚丁酸):研域化学试剂有限公司;NAA(萘乙酸):上海锐聪实验室设备有限公司;香蕉汁:自制。1.2方法1.2.1活化、灭菌在园地栽种的石斛丛株上剪取其生长1年以上的茎,去掉叶,去掉灰尘,在无菌操作台上用75%乙醇消毒30s后再用0.1%HgCl2浸泡灭菌15min,用无菌水冲洗3次,如此重复进行3次灭菌。灭菌过程中轻轻搅拌茎段使灭菌更加彻底。1.2.2培养基的制备外植体诱导培养基:MS为基本培养基,以及不同浓度的BA和IBA;原球茎诱导培养基:MS+BA2.5mg/L+IBA0.5mg/L;原球茎分化培养基:MS为基本培养基,以及不同浓度的BA、NAA和香蕉汁;生根壮苗培养基:处理组1:MS+NAA0.2mg/L+香蕉汁20%,处理组2:分阶段补加:(1)MS+NAA0.15mg/l+香蕉汁5%;(2)MS+NAA0.20mg/L+香蕉汁7.5%;(3)MS+NAA0.25mg/L+香蕉汁10%mg/L。培养基用0.1mol/L的HCl或NaOH调节pH5.8,121℃0.1MPa下高压灭菌20min。1.2.3实验用ba和i-ba进行比较实验以铁皮石斛茎段为外植体,将已灭菌的外植体接种于原球茎诱导培养基。实验中采取不同浓度的BA和I-BA进行比较实验。挑选长势均一、生长状态好、无分化、颜色嫩绿的原球茎进行继代培养,继代控制在8~10代。观察7个不同浓度BA和IBA组对原球茎的诱导率。1.2.4ba、naa、香蕉汁组对原球茎分化的影响将大小一致的原球茎团接种到分化培养基中,进行再分化培养。实验考察5个不同浓度的BA、NAA和香蕉汁组对原球茎分化的影响,每组实验接种的总原球茎团数为30、60d时观察并统计其原球茎再分化出芽的数据。1.2.5分组补加培养待分化的铁皮石斛长到约2cm高时,转接到壮苗生根培养基。在实验中,比较了两种培养方法:分组1(对照组)直接转接到处理组1的培养基上;分组2(实验组)采取分阶段补加技术,先用培养基(1)使苗快速长高,待小苗长到3~4节,3~5cm高时,再加入培养基(2)培养成中植株,最后接种在培养基(3)培养成大植株。每组200瓶苗,观察不同营养液添加方法对铁皮石斛生根长度、生根数及生根率的影响。1.2.6人工光照对铁皮石斛苗生长的影响实验选取处于生根壮苗阶段长势均一、生长状态好的瓶苗分为两组,对照组(白炽灯组)和实验组(特定光谱节能灯组),每组100瓶苗。生长1个月后测量铁皮石斛苗的鲜重、蘖芽数、株高以及茎粗,观察不同人工光源对组培苗生长的影响。培养室温度控制在(25±1)℃,光照强度为1500~2000Lux,光照12h/d。1.2.7水培育苗、放养常规的炼苗方法是是将试管苗移至炼苗房进行炼苗,让试管苗逐渐适应自然环境,而我们采用水培驯化的方法进行炼苗。实验选取长势均一、生长状态好的可以出苗的瓶苗分为3组:不炼苗组、常规炼苗组和水培驯化炼苗组,每组200瓶苗。不炼苗组处理方法:用镊子将组培苗取出,放入清水盆中小心洗尽根部琼脂,晾干后直接移栽到大田。常规炼苗组处理方法:将组培苗从培养室取出,放在室外遮荫棚强光闭瓶炼苗10~20d,遮荫度为50%~70%,然后打开瓶口再放置5~7d。准备育苗盘,育苗盘中放置已消毒的基质(碎石子和锯木屑),喷水使基质刚好浸透,将组培苗从瓶中取出洗尽移栽至育苗盘,最后将育苗盘摆入驯化室中正常管理。水培驯化炼苗组处理方法:准备营养液槽,将打好小孔(φ5mm)的泡沫板(厚5mm)架于营养液槽上;将铁皮石斛组培苗取出用15~20℃的清水冲洗,沥去多余水分,栽种于泡沫浮板的孔隙中,将营养液注入营养液槽中,使营养液浸没根系,开动营养液槽的循环水泵,流速5m/s;控制好光照(5000~10000Lux)、温度(15~28℃)、相对湿度(80%~90%),每天喷雾3次,微量通风,进行种苗炼化。观察指标为:铁皮石斛种苗根系发达,再生根增多,茎增粗,叶片变绿,变厚,即可以拔出进行大田移栽。水培驯化炼苗营养液配方:硝酸钾1g、硫酸铵0.2g、硝酸铵0.1g、硫酸镁0.11g、磷酸二氢钾0.1g、氯化钙0.06g、硫酸锰0.02g、硫酸亚铁0.03g、硫酸锌0.005g、水1000mL。2结果与分析2.1ba和ip-1、mba浓度对原球茎诱导的效果实验结果如表1所示,铁皮石斛种苗组培过程见图1。分组的1组中没有添加激素,没有原球茎的产生,而添加了BA和IBA的诱导率显著提高。当BA浓度为2.5mg/L、IBA浓度为0.20mg/L时诱导出原球茎的茎段数最多,诱导率达83.3%;当BA浓度4.0mg/L、IBA浓度为0.30mg/L时茎段受抑制,不出芽,最后死亡。说明原球茎诱导的培养基中激素浓度应控制在一定范围内,实验优选出铁皮石斛原球茎诱导的最适培养条件为MS+BA2.5mg/L+I-BA0.2mg/L。2.2整地度、分化率原球茎进行分化可形成丛生芽,在培养过程中均会出现一定程度的分化,但不同激素浓度配比对原球茎分化整齐度、分化率影响不一,一定浓度的香蕉泥也有利于原球茎的分化,且可提高分化率。不同浓度组合的BA和NAA及香蕉汁对原球茎分化结果如表2所示,三者配比使用,明显促进原球茎分化,优选出最适于原球茎分化的激素浓度配比为BA1.5mg/L+NAAl.2mg/L+5%香蕉汁的MS培养基。2.3段补加技术对铁皮石斛幼苗根诱导及生根的影响从表3可以看出,在生根壮苗阶段,采取营养液分阶段补加技术更有利于铁皮石斛幼苗根诱导及生根,其诱导率达95%,且苗生长旺盛,根、茎生长健壮,还减少了因更换培养基可能对组培苗根系造成的损伤。2.4组培光对补光效果的影响采用人工光源在棚室内直接给作物补光是促进植物生长的有效途径,而高效节能地对植物补光的理论依据主要是植物对光的选择性吸收的理论。从表4可以看出,实验中采取组培特定光谱节能灯,不仅能很好的满足组培苗光合作用的要求,而且又能减少光的耗损和光热的排放,很好地响应了节能减排的低碳号召。所以优选组培特定光谱节能灯为照射光源。2.5炼苗的深度2表5结果表明,铁皮石斛进行水培驯化炼苗时,根系浸没深度在40%~60%之间效果最好,所以优选这个深度进行炼苗。而从表6可知,水培驯化炼苗较常规炼苗有一定的优势,炼苗效果好,移栽成活率高,从而降低种苗的成本,增加相应种植的产量。3组培苗的光照利用技术培养原球茎的目的是继代繁殖、保存种子、扩大繁殖倍数。通过组织培养的方式可在短时间内提供大量种苗,对于铁皮石斛GAP种植具有重要意义。本实验研究立足于铁皮石斛种苗的工厂化生产,采用茎节为诱导对象,在常规组培繁殖技术上采用了组培特定光谱节能灯技术,利用组培苗光合作用所需的特定光谱进行光照,促进组培苗光合作用,同时减少了非光合作用所需光波量而达到降低能耗和减少热能产生的效果;采用了培养营养液分阶段补加新技术,保证了在生根生长过程中给铁皮石斛组培苗提供足够的营养成分时,不因更换培养基而造成组培苗的根系损伤;采用了水培驯化炼苗技术,能使种苗快速适应非培养环境,并快速生长、增粗、生根、变绿;通过以上技术的应用,缩短了种苗组培育苗周期,解决了从组培苗到大田栽培的技术,使组培苗移栽成活率达98%,种苗的成本降低,种植的产量相应增加。铁皮石斛组培快繁技术在生产上的优化,成功为兰科植物种质