红豆杉紫杉醇的提取途径

红豆杉紫杉醇的提取途径

红杉是红杉科的一种植物。这是四种古老的佛教植物中仅存在的56种植物中最珍稀的一种。全世界共14种,我国有4种和1变种,即东北红豆杉、云南红豆杉、西藏红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉。该属植物是我国二级珍稀濒危植物。红豆杉因其次生代谢产物紫杉醇的显著治癌效果而倍受关注。紫杉醇(pacilitaxel,商品名taxol)是美国化学家Wall和Wani等(1967年)首先从太平洋紫杉(短叶红豆杉,Taxusbrevifolia)树皮中提取出具有独特抗癌活性的二萜类化合物。它是当今世界公认的广普、高活性的抗癌药物。其独特的作用机理在于:它可以结合于微管蛋白的P亚基的N末端的31个氨基酸上,通过促进微管双聚体装配,保持微管蛋白稳定,使细胞周期停滞于有丝分裂期,阻止微管解聚,从而抑制癌细胞的有丝分裂。紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌、子宫癌、胃癌、肺癌等癌症的单药有效率高达16%~59%。最近研究发现,紫杉醇对类风湿性关节炎、老年性痴呆症等都有很好的疗效。由于紫杉醇在红豆杉植物细胞中含量极低,仅为0.01%左右,从3~6棵百年生大树的树皮中提取到的紫杉醇仅可治疗一个癌症患者。自然界中天然红豆杉现存数量很少,生长缓慢,极少成林。近10多年来,由于不合理的过度砍伐使得该树种数量锐减,南方红豆杉赖以生存的环境也已受到严重威胁,该树种已处于濒危状态。在1991年林业部公布的珍稀保护树木中,南方红豆杉被列为一级保护树种。紫杉醇的提取或生产日益成为许多国家研究的热点,希望能找到一条既能满足对紫杉醇需求又不危及红豆杉生存的途径。获取紫杉醇途径归结为以下几种:植物组织培养途径、红豆杉的人工种植途径、生物合成途径、化学合成及微生物生产途径。其中植物组织培养方法因具有如下特殊的优点而成为商业化生产较有效的途径:可以在生物反应器中大规模培养细胞,并且通过控制培养条件使培养细胞合成大量紫杉醇;培养细胞除合成紫杉醇外,还可以生产紫杉醇半合成的前体物质及其他有抗癌活性的、原植体内不含有的化合物。日本学者曾从短叶红豆杉和东北豆杉获得愈伤组织,筛选到的细胞培养4w后增殖5倍,紫杉醇的含量达到0.05%,是天然植物中含量的10倍。红豆杉细胞培养目前已成为解决紫杉醇药源紧缺的重要途径之一。1杉木组织培养研究1.1台湾红豆的诱导诱导愈伤组织的生长红豆杉的幼茎、形成层、树皮、针叶、成熟或未成熟的胚以及假种皮均可用于愈伤组织的诱导。张宗勤等研究发现,枝条直径2mm左右或幼嫩的枝条在用HgCl2消毒处理时很容易受伤害而变褐,因而不能产生愈伤组织。革质叶片和受苞片包被球花,可以忍耐药剂较长时间处理,受伤害不重且污染率不高。在叶片诱导中,愈伤组织出现情况不一,有的沿叶片边缘,有的沿叶尖端,个别在叶基部。叶脉向上的诱导率为89.6%,叶脉向下的诱导率为93.4%,差异不明显。叶前部愈伤组织诱导率45.5%,中部34.7%,后部38.1%。此外,种胚、芽也常用于组织培养。利用茎尖或芽培养技术来大量繁殖紫杉醇含量高的优良无性系是一项很有应用前景的技术。ChangTsai等(1998年)进行了台湾红豆杉的芽培养和快速繁殖。将顶芽部分切成3cm长的外植体,顶芽以下的部分切成长1~3cm并且带有1~3个侧芽的外植体,接种于含1mg/L6-BA、1g/L活性炭和30g/L蔗糖的1/2MS培养基上。培养60d后,外植体长出新芽,将新芽切下,接种在含2.5mg/L6-BA、1mg/LNAA、1g/L活性碳和30g/L蔗糖的1/2MS培养基上,培养3个月后,每个外植体增殖出多个芽,但大部分培养物出现褐化现象,此时可将它们转入含100mg/LAgNO3、1g/L活性碳和30g/L蔗糖的1/2MS培养基上培养,褐化现象可得到明显改善。将健壮芽切下转到不含激素的培养基上,使芽进一步伸长。当芽长1.5~2.0cm时,将其转入附加2.5mg/LIBA的培养基上,进行生根培养,生根率达50%。孙彬贤等对南方红豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)、云南红豆杉(T.yunnanensis)、欧洲红豆杉(T.baccata)和东北红豆杉(T.cuspidata)的幼茎和针叶在加有不同激素和添加物的培养基上诱导愈伤组织,筛选后获得适合南方红豆杉、云南红豆杉、欧洲红豆杉和东北红豆杉愈伤组织生长的培养基分别为B5+3mg/LNAA+0.1mg/LKT、B5+3mg/LNAA+0.1mg/LKT,B5+2mg/L2,4-D+0.1mg/LKT+0.2%酪蛋白水解物和B5+1mg/L2,4-D+2mg/LNAA+0.1mg/LKT。继代培养6代以上的红豆杉愈伤组织进行悬浮培养,继代5次以上的红豆杉悬浮培养细胞进行紫杉醇含量的测定,其中云南红豆杉含量最高,达0.019%,南方红豆杉含量居中(0.009%),而欧洲红豆杉和东北红豆杉含量较低,分别为0.004%和0.006%。赵沛基等研究发现,在MS培养基上生长的云南红豆杉离体胚的萌发率较高,达80%;成熟种子胚的萌发率高于未成熟胚;胚的萌发率随着种子贮存时间的延长而下降;胚乳有助于胚的萌发。胚培养1个月左右可获得正常的红豆杉幼苗,成苗率15%~20%。幼苗中的紫杉醇含量为0.004%,远远低于成年树皮中紫杉醇的含量(0.02%)。1.2愈伤组织的诱导培养大量研究结果表明:培养基的类型、植物生长调节剂浓度及组合对愈伤组织的诱导、细胞分裂、组织分化都是极为重要的。常用的培养基有MS、B5、SH、N6、TA等。其中以基本的或改良的B5、SH等诱导效果最好。肖尊安等采用墨西哥红豆杉(Taxusglobo-sa)成年树当年生成熟枝为外植体进行诱导培养,愈伤组织诱导培养基为SH、B5和NN69基本培养基,添加NAA2.0mg/L、BA0.1mg/L、3%蔗糖和0.6%琼脂。接种后2~4w,诱导出白色疏松的愈伤组织;随着愈伤组织逐渐生长,愈伤组织颜色转变为棕色或褐色。接种后6w,NN69培养基的出愈率最高,达67.5%;其次为B5培养基(32.6%)和SH培养基(31.6%)。愈伤组织继续生长2~4w后,所有茎段愈伤组织生长缓慢直至停止,愈伤组织颜色变为棕褐或黑褐色。经过4~8w的停滞生长后,大部分茎段愈伤组织重新恢复生长。此后,愈伤组织每6w继代1次。在继代培养中,SH培养基上的愈伤组织生长最快,其次为B5和NN69培养基。1.2.1附加2,4-d和naa对芽愈伤组织的诱导效果经研究发现,含2,4-D的MS培养基,添加NAA对幼茎愈伤组织的诱导效果明显好于不添加NAA的培养基。不仅诱导率较高,而且出现愈伤组织的时间略早。雄球花外植体在1/2MS+2,4-D2.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基上诱导频率最高,所产生的愈伤组织块也较大。在芽愈伤组织的诱导中,MS培养基附加2,4-D组合的效果好。KT对芽愈伤组织的诱导有很大影响。在附加KT的培养基中,芽根本无法产生愈伤组织,大约4w后,芽渐渐变褐而死亡。茎段和芽相比,芽的产生愈伤组织的时间早,诱导率高,而且愈伤组织的生长速度快。在胚源愈伤组织的诱导中,附加NAA时,愈伤组织诱导率明显高于2,4-D,且NAA组合愈伤组织长势好,呈淡黄色、黄色和淡绿色,含水量小,愈伤组织较疏松。刘铁燕等研究表明,当2,4-D和NAA配合使用时,东北红豆杉愈伤组织诱导率要比不含NAA的培养基高1.5~2倍,而且前者诱导出愈伤组织的时间比后者早5~11d。可见,在MS培养基中配合使用一定浓度的2,4-D和NAA,可有效地提高东北红豆杉愈伤组织的诱导率。1.2.2铵态氮培养基o3培养基中氮源对细胞的生长影响较为明显。在B5培养基中加入一定浓度的NH4NO3,其生长速度是对照2~3倍。培养基中硝态氮浓度高有利于细胞生长,铵态氮高有利于紫杉醇积累,在培养12d时,将硝态氮培养基更换成铵态氮培养基,紫杉醇产量提高1.6倍。但以高浓度的NH4+作为唯一的氮源,却抑制细胞的生长。1.2.3蔗糖和葡萄糖碳源即糖浓度也是影响东北红豆杉愈伤组织诱导的一个关键因素,培养基中糖的种类和浓度直接影响细胞干重和紫杉醇产量。已有实验证明,蔗糖是最好的碳源。蔗糖可以被分解成果糖和葡萄糖,果糖和葡萄糖都能较强地抑制过氧化物酶的活性防止褐变,又能显著地提高紫杉醇的产量和促进细胞生长,使愈伤组织生长势旺盛,诱导周期短。高浓度蔗糖能够促进紫杉醇的合成,并且随着蔗糖浓度的升高,细胞干重也相应增加。1.2.4紫杉醇的生物合成紫杉醇的分子式为C47H5NO114,是具有萜类环状结构的天然次生代谢产物,主要由紫杉烷环和侧链组成。研究其生物合成对于人为定向地提高合成效率以及克隆合成中的关键酶基因,进而提高紫杉醇的合成量,意义十分重大。紫杉醇的生物合成包括紫杉烷环(骨架)的合成、侧链合成以及将二者相连三步。据报道,苯丙氨酸、亮氨酸和乙酸钠都是紫杉醇的前体,其中乙酸钠不仅掺入到乙酰基,而且还能掺入到苯环和紫杉烷的骨架中。关于紫杉醇的生物合成国内外作了大量工作,已提出了生物合成假设途径。随着对合成途径的进一步研究和分子生物学技术的运用,用基因工程方法对细胞进行改造,将大大提高生物转化的效率。人们有可能通过某些关键酶的发现、纯化和基因克隆而使紫杉醇合成途径得到突破并取得应用成果。ZamirLO等用放射性同位素标记的前体对红豆杉细胞进行喂养,结果表明,紫杉醇的三环二萜骨架来自羟甲基戊酸,C10位的乙酰基来自乙酸,C13位酰基侧链中的CH3CHCH(OH)COO-来自phe。吴奇君等研究发现,果糖可以使紫衫醇产量增加63.89%,在有果糖协同的作用下,加入前体(0.05mol/L乙酸钠、0.05mo1/L苯丙氨酸、0.1mol/L苯甲酸钠)可显著提高紫杉醇的合成。1.2.5诱导子的检测诱导子是能够诱导植物细胞中一种或几种反应,并形成特征性自身防御反应的分子。它可以通过改变次生代谢途径中催化酶的酶活力或活化次生代谢途径中特定酶基因,诱导新酶的形成,引起次生代谢途径和反应速率的改变,从而提高次生代谢产物的产量。在对红豆杉细胞培养生产紫杉醇的研究中,使用的诱导子主要有两种:(1)生物诱导子(bioticelicitors),主要是高压灭活的真菌、细菌、酵母的细胞壁萃取物、滤液或孢子中得到的物质、茉莉酸甲酯、水杨酸和花生四烯等。(2)非生物诱导子(abioticelicitors),包括化学协同物质(重金属、钒酸盐、稀土金属等)和一些人工合成化合物(如阿魏酸、苯甲酸等)。低浓度时,诱导子的浓度改变可以显著影响次生物质的积累速率。随着浓度的增加,影响的程度将会减小,甚至对细胞产生害作用。1.3培训方法1.3.1外植体的诱导红豆杉组织培养的污染率较高。尤其是由于B5培养基表面溶液较多,外植体污染率非常高。但B5培养基对愈伤组织的诱导效果明显好于MS培养基,而后者对愈伤组织的生长比较适宜。因此,可以采取“分段培养法”。即先将外植体接种于MS培养基中,每2~3d转移一次培养基,去除污染的外植体,待外植体度过污染关后,再将其转移至B5培养基上进行诱导。在继代培养中,再将愈伤组织从B5培养基上转回到MS培养基上进行生长培养。这样既能保证外植体有较高的诱导率,又能提高红豆杉的细胞生物量。1.3.2继代成活率的培养无论是胚源还是茎源的红豆杉愈伤组织,早期继代培养过程都会因为愈伤组织自身分泌一些褐色有毒物质而使继代成活率普遍很低。张长河等研究发现,使用看护培养和条件培养使继代成活率提高了1倍。用茎源的生长良好的红豆杉细胞株Y8、NF、TD8可对诱导出的胚源愈伤组织进行看护培养。取上述三种细胞株悬浮培养15d的无细胞培养液(条件培养液)与新鲜改良B5(琼脂加倍)以1∶1比例,在45℃左右混合均匀,可制成条件培养基。1.3.3细胞生长和细胞聚集体两步法即生长培养和生产培养。生长阶段也是细胞聚集体的形成阶段,红豆杉细胞生长并形成细胞聚集体。12d后细胞悬浮培养物与生产培养基按体积1∶1混合,由生长培养转入生产培养。在100μmol/L茉莉酸甲酯作为诱导子条件下,该体系紫杉醇产量较对照组提高1倍。将生长培养不同时期的细胞转入生产培养,对其细胞生长、细胞聚集体和紫杉醇的形成有不同影响。生长培养12d后转入生产培养对细胞生长、细胞聚集体和紫杉醇形成最有利。此时细胞已进入稳定后期,细胞的分化程度高且活力也高。而生长培养15d后转入生产培养,虽然细胞亦有很高的分化程度,但由于营养的缺乏和/或代谢废物的抑制,细胞合成紫杉醇的能力却降低。1.4氧化酚类物质在红豆杉愈伤组织的诱导及继代培养过程中,常常发生培养细胞褐变现象,轻者影响细胞生长和繁殖,重者导致细胞死亡。褐变原因主要是由于酚类被氧化为醌类物质,抑制很多代谢酶的活性。由于红豆杉细胞培养发生褐变的原因复杂,与材料的基因型和生理状态、培养基成分和激素配比等因素有关,因此要防止褐变发生,减轻褐变危害,除了要选择合适的外植体、培养基和适宜的激素组合外,添加抗褐变剂是方便有效的常规手段。无机盐、金属元素、抗氧化剂、吸附剂等均能直接影响褐变反应。1.4.1无机盐浓度对褐变的影响从对褐变的影响角度来看,PO43->NH4+>NO3-。无机盐的浓度越低,褐变强度越低。培养基中无机盐浓度过高,可致使酚类物质大量产生,导致细胞褐变。降低盐浓度可以减少酚类外溢,从而减轻褐变。1.4.2ag+降低褐变的作用Cu2+、Mn2+是酚类合成及氧化酶类的组成成分与辅助因子,因此Cu2+的增加便可加重褐变,而Mn2+不如Cu2+明显。植物细胞内源乙烯水平的升高也会加深褐变,Ag+可抑制乙烯的增加,所以Ag+在适当的水平可显著抑制褐变。例如,在台湾红豆杉的芽培养过程中,将培养物转入含100mg/LAgNO31/2MS培养基上培养,褐化现象可得到明显的改善。1.4.3培养细胞的褐变抗氧化剂的应用可在一定的程度上减轻褐变。培养基中添加二硫苏糖醇(DTT)和柠檬酸(CA),培养细胞褐变明显减轻,而且生长速率也很高。硫代硫酸钠(Na2S2O3)抗褐变的效果最差,维生素C、半胱氨酸(Cys)有一定的抗褐变效果,但不如DTT和CA效果明显。1.4.4防止褐变需要生物活性物质的支撑活性炭(ActivatedCharcoal,AC)作为吸附剂可以吸附细胞的有毒代谢产物,AC除了吸附作用外,还能在一定程度上降低光照强度,从而减轻褐变。但AC抑制褐变的同时也有副作用产生,即在吸附有毒物质的同时,也要吸附培养基中的生长调节剂。因此,在加入1.5%的活性炭的同时,要提高培养基中激素的水平。聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpynolidone,PVP)也常用于褐变的防止。吸附剂的加入时间很重要。在细胞悬浮培养过程中,AC一般在12~16d左右(对数生长期)加入效果最好,细胞生长指数也很高;而PVP在对数生长期及以前加入防褐变和生长情况均比较好。2苗木放养繁殖方法红豆杉种子资源的保存和种苗快速繁育是紫杉醇原料林营建的关键,大面积营造红豆杉人工林是解决紫杉醇原料的有效方法之一。近年来关于红豆杉育苗、栽培等有很多报道。张宗勤等(1998年)对红豆杉种子发育、扦插繁殖、栽培造林等环节进行了深入的研究。用红豆杉种子繁育苗木时,要注意种子的储存方式,要沙种混藏或控温处理,这对越冬后出芽和打破休眠具有很好的效果。播种前要搓伤种皮、温水浸种、激素处理。出苗后遮阴是育苗的关键。遮阴可防止苗木高温灼烧、保持湿润,透光度在40%为宜。东北红豆杉和南方红豆杉出苗率均可达到70~80%。进行扦插繁殖,春季以嫩枝为好,秋季应以硬枝为宜,扦插生根率春季略好于秋季,低棚遮荫与围地薄膜覆盖后成活可达80%~90%,而常规扦插仅为3%~20%。影响扦插成活率的因素还有年龄、温度、药剂处理、基质、季节等,应综合考虑各种因素,使红豆杉扦插繁殖达到最佳效果。各种红豆杉扦插繁殖率分别为:东北红豆杉95%、中国红豆杉86%、云南红豆杉90%、南方红豆杉97%。3紫杉醇的化学合成和微生物生产3.1紫杉醇的合成根据研究报道,可从红豆杉植物中分离出10-去乙酰浆果赤霉素Ⅲ,虽然活性远低于紫杉醇,但可以从针叶中提取该物质,经过四步反应合成紫杉醇。以NicolaouKC为首的美国研究小组在1994年报道了通过化学方法合成紫杉醇的结果,但关于化学合成的研究还没有突破性的进展,目前还不具有应用价值。3.2内生真菌产生紫杉醇的能力StierleA等(1993年)从短叶红豆杉韧皮部分离到一种寄生真菌(Taxomycesandreanae)可以在特定的培养基中产生紫杉醇及其相关化合物。随后许多研究者从红豆杉属的其他植物中陆续分离到