大肠杆菌培养和分离

微生物什么是微生物呢？微生物：形体极小，结构简单，凡是肉眼看不见的生物。只有在光学显微镜和电子显微镜下才能看清楚的生物。微生物的类群3真菌界(单或多C)：例如酵母菌、霉菌、真菌4单细胞动植物例如草履虫、变形虫，单C藻非细胞结构1病毒细胞结构原核细胞:2原核生物界(单C)：细菌、蓝藻、放线菌真核细胞:微生物的新陈代谢类型同化作用：自养型，异养型异化作用：需氧型，厌氧型，兼性厌氧型。自养需氧型：光合细菌（蓝藻），硝化细菌等异养需氧型：醋杆菌，真菌，固氮菌等异养厌氧型：乳酸菌，假丝酵母菌等异养兼性厌氧型：酵母菌，大肠杆菌。微生物的作用绝大多数的微生物对人类无害，90%以上对人类有利。用途：食品发酵：酒，醋，酱，酸奶，泡菜，腐乳……制药：生产抗生素：放线菌和霉菌，

生产酶制剂：治理环境污染：处理废水，降解塑料……一、细菌结构

细胞壁，细胞膜，细胞溶胶，拟核DNA，核糖体，质粒，鞭毛等革兰氏阴性，兼性厌氧，一般对人体无害，有些菌株有害，一旦进入泌尿系统，都有危害。用途：基因工程受体菌。菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。

大肠杆菌菌落不同细菌菌落不同实验一

大肠杆菌的培养

与分离实验内容：

1细菌培养：将大肠杆菌接种到LB液体培养基扩大培养。2细菌分离：将大肠杆菌从液体培养基中接种到LB固体培养基，形成单菌落。目的为了分离纯化。实验内容：

1细菌培养：用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌。2细菌分离：用LB固体培养基划线分离，形成菌落。实验过程Ⅰ准备阶段：1培养基配制（两种），培养皿，培养用到的各种接种工具清洗，灭菌，2操作环境灭菌，3操作人员消毒Ⅱ操作阶段：培养基成分（culturemedia）

按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。营养成分：碳源、氮源、生长因子、水和无机盐。培养基成分细菌:真菌:“喜荤”,蛋白胨,牛肉膏,酵母提液,Nacl等“喜素”,无机物或蔗糖溶液配置的豆芽汁LB培养基的配方培养基成分各成分的量蛋白胨0.5g酵母提取物0.25gNaCl0.5gH2O加至50ml1配制培养基实验准备工作

碳源：酵母提取物和蛋白胨

氮源：蛋白胨Nacl的作用：维持渗透压

培养基配置流程：

计算-称量-溶解-定容-调ph--灭菌蛋白胨酵母提取物培养基的种类

按照物理性质划分培养基固体培养基（加琼脂）液体培养基

液体培养基能形成菌落，用途：微生物的分离、鉴定、保存、计数等主要用于扩大培养固体培养基琼脂？红藻中提取的多糖,在98℃以上熔化，44℃以下凝固，常温下凝结成有弹性的凝胶。凝固剂

琼脂浓度的多少决定了培养基的硬度。培养基配置步骤计算称量：配固体培养基时还需加琼脂溶化：加热溶化，定容调节PH灭菌

细菌6.5-7.5中性偏碱真菌5.0-6.0中性偏酸培养工具的灭菌玻璃制品：试管、培养皿、三角瓶、移液管、玻璃刮刀塑料制品：取样器枪头金属制品：接种环，镊子、棉花：用来制作棉花塞。棉花塞：透气，又过滤细菌，不能用脱脂棉。高压蒸汽灭菌法：仪器：高压蒸汽灭菌锅121℃1kg/cm215min计时：达到设定的压力或温度都开始计时使用步骤：先加热排气再达压力后灭菌15min后关闭电源，冷却，待锅内外压力相同时才能打开。高压蒸汽灭菌法

高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点有三：

1、湿热灭菌时菌体蛋白容易变性；

2、湿热穿透力强；

3、水蒸汽变成水时可放出大量热增强杀菌效果，因此，它是效果最好的灭菌方法。灭菌的方法1、高压蒸汽灭菌（最常用）培养基，培养皿，无菌水，各种玻璃制品2、灼烧灭菌接种环，玻璃刮刀（使用过程中），试管口等3、干热灭菌（160-170℃下加热1-2h。）金属制品玻璃砂漏斗4.过滤灭菌法(不能高温加热的物质)仪器：G6玻璃纱漏斗物质：葡萄糖，尿素，抗生素等微生物培养：无菌操作技术获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开。超净台实验准备工作

2灭菌和消毒无菌操作目的：为了避免被杂菌污染。1对实验操作空间：超净台：紫外线灭菌，过滤风桌面：酒精擦拭，酒精灯外焰附近操作2.操作者衣服和手进行：清洁和消毒，70%酒精3.避免已灭菌处理的材料用具和周围物品的接触消毒的方法1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法

70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用70%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气、高锰酸钾消毒……

（1）消毒：

利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。消毒与灭菌的区别

（2）灭菌：

灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。

以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌的过程。实验1大肠杆菌的培养和分离超净台上紫外灯和过滤风实验过程：准备阶段：1培养基的配制，2灭菌和消毒操作阶段：1倒平板：分装固体培养基倒平板：将已灭菌的固体培养基倒入培养皿的过程。

分装培养基：1倒平板：

将灭菌后的固体培养基倒入培养皿培养基冷却到60度时倒入2培养基的分装（试管，三角瓶，培养皿）倒入三角瓶和试管（漏斗法）1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论

答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。操作一：LB液体培养：

扩大大肠杆菌数量条件：37℃，摇床上，振荡培养2：接种①划线分离法

平板划线分离法

原理：接种环沾菌液后再固体培养基划线，划线过程中菌液逐渐减少，细菌也减少，最后，细菌间距离增大，培养后形成单菌落。问题讨论

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。稀释涂布平板法1稀释2涂布固体培养基：涂布分离形成的菌落3培养：37℃恒温培养

仪器：恒温培养箱3.进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？

答：防止冷凝水低落影响菌落形成而达不到分离的目的。因此，恒温培养时，培养皿必须倒置。分离纯化大肠杆菌的方法两种：稀释涂布平板法和平板划线法实验1