连钱草脂溶性提取物提取工艺的研究

连钱草脂溶性提取物提取工艺的研究

连钱草是嘴唇科植物的活血丹（nakai）kubar。在《本草纲目》中，它被称为金钱草。在历史上和当地药物中，金钱草被广泛用于治疗肝结石。中国药典77年版将报春花科植物过路黄(LysimachiachristinaeHance)收载为正品金钱草,活血丹被该版药典以连钱草收载,收载的连钱草功能主治为清热解毒、利尿排石、散瘀消肿,用于尿路结石,肝胆结石,湿热黄疸,跌扑损伤。以后的各版药典将连钱草功能主治修改为利湿通淋、清热解毒、散瘀消肿。用于热淋、湿淋、湿热黄疸,疮痈肿痛,跌扑损伤,再没有收载肝胆结石之功效。现代普遍认为连钱草用于尿路结石较好。德国用活血丹同属植物欧活血丹(GlechomahederaceaL.)脂溶性提取物制成的天然药物爱活胆通,用于早期胆固醇性结石及孤立性、混合性以胆固醇为主的胆结石,取得良好效果。有文献报道,连钱草与欧活血丹化学成分与疗效均较相似。为获得连钱草脂溶性提取物,进一步进行药效学研究,采用正交设计法探讨连钱草脂溶性提取物的提取工艺。1材料和机器1.1材料表面连钱草来源于亳州永刚饮片厂有限公司,批号为050510,经安徽中医学院王德群教授鉴定为唇形科活血丹。1.2日本德国UV-1700型紫外分光光度计(日本岛津公司);AR1140电子天平(德国赛多利斯公司);DZG-6050真空干燥箱(上海申信实验仪器有限公司)。2方法2.1透心时间测定准确称取100g连钱草粗粉,加入5倍量的95%乙醇浸泡,每隔10min滤出并测定未被吸收的乙醇液。结果60min后滤出的乙醇液的体积基本不变,说明已经透心,即连钱草泡透心时间为60min。称取60min泡透心时的连钱草粉湿重,计算得连钱草吸液率为100%。2.2各因素综合评价欧活血丹治疗胆石症的有效成分为其脂溶性成分。另外,现代研究认为膳食中摄入较多植物甾醇有助于减少胆固醇的吸收,有助于降低胆石症的形成机率。所以选取醚溶性浸出物、植物甾醇含量和出膏率一同作为评价指标进行综合评分。评分按主次,因醚溶性浸出物可能富集连钱草最多最主要的生理活性成分,所以醚溶性浸出物含量Y1的权重定为0.50,植物甾醇含量Y2的权重定为0.30,出膏率含量的权重Y3定为0.20,即:Y=Y1/Y1max×0.50+Y2/Y2max×0.30+Y3/Y3max×0.20。2.3醇的含量是由植物酒精含量的测量引起的2.3.1解并稀释至文明取胆固醇约25mg,精密称定,置25ml容量瓶中,加氯仿溶解并稀释至刻度,摇匀。精密吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml,分别置10ml的棕色容量瓶中,加氯仿至刻度,分别制成约0.1～0.5g·L-1的溶液作为对照品溶液。2.3.2供试品溶液制备精密称取样品0.3g,置具塞锥形瓶中,精密加入氯仿25ml,稳定重量,超声10min,用氯仿补足减失的重量,滤过,取续滤液,作为供试品溶液。2.3.3最大吸收度的测定精密吸取醋酐2ml,置具塞试管中,加入硫酸1滴,立即精密加入对照品溶液1ml,混匀,再立即倒入比色池中进行反应,并同时于625nm波长处观察其反应的吸收度变化情况,记录最大吸收度As的值,其中以氯仿1ml代替上述反应中的对照品溶液,同法操作,作为空白对照。2.3.4空白对照测定以精密加入样品溶液1ml代替上述As测定中的对照品溶液,同法操作,记录最大吸收度At的值,而以氯仿2ml代替其中的醋酐同法操作,作为空白对照。2.3.5浓度对反应值的影响精密吸取上述5个不同浓度的对照品溶液,分别按上述测定方法进行操作,并以浓度C(mg·L-1)对测得的反应值As作图,得方程y=0.0016x+0.0071,r=0.9999,表明在100～500mg·L-1范围内浓度对反应值呈良好的线性关系。2.4因子的提取效果以乙醇为提取溶媒,以乙醇浓度、用量、提取时间为考察因子,进行L9(34)正交试验,并以醚溶性浸出物量、出膏率、植物甾醇的含量为评价指标,筛选最佳工艺条件,结果见表1、表2。查表可知,F0.90(2,2)=9.0,F0.95(2,2)=19.0,F0.99(2,2)=99.0,因此因子A在显著水平0.01是显著的,因子B不显著,因子C在显著水平0.10是显著的。由表2直观分析可知,各因子对连钱草提取效果的影响程度依次为A>C>B,即醇液浓度>提取时间>加醇倍数。由表3分析结果可知,上述实验中因子A与C在不同显著性水平有影响,所以选择最好的水平,取A3C1,因子B影响不显著,节约成本选择B1。综合考虑,采用组合是A3B1C1,即以95%乙醇为提取溶液,第一次加7倍量乙醇,浸泡1h,回流提取1h,第二次加6倍乙醇,回流提取1h。2.5重复实验取连钱草,按上述结果做3次平行实验,分别测定出膏率及醚溶性浸出物和植物甾醇的含量,偏差均<2%,结果表明重现性好。3影响新生儿血肿指标的因素欧活血丹治病疗胆石症的有效成分为其脂溶性提取物,故可参照选择醚溶性浸出物含量作为醇提工艺的评价指标之一。由于连钱草成分的多元性和复杂性,仅用醚溶性浸出物含量并不能全面反应其药效学特性。早在上个世纪50年代,人们就已经知道从膳食中摄入植物甾醇越多,胆固醇的吸收率就越低,血清中的胆固醇水平就越低。流行病学调查资料和研究证实,血清脂质是影响胆汁脂质成分和比例的重要因子,脂质代谢异常是导致胆汁理化状态变化并向成石过渡的一个重要因子。所以,降低血脂水平能减少胆石症的形成。植物甾醇能够阻止胆固醇的吸收,降低血清胆固醇,从而使胆汁中的胆固醇浓度维持一定的平衡,不致过高而形成致石胆汁。根据中药“多靶点、多方位”的原则,为避免活性成分的损失,故又另选取其植物甾醇含量和出膏率一同作为指标进行综合评分。鉴于醚溶性浸出物、植物甾醇含量和出膏率指标间的矛盾性,在数理统计时一般根据重要程度给每一个指标一个权重,用权重影响该指标在方案得分中所占的分值。由于中药成分复杂,有效的物质基础不明确,在工艺设计前应分析中药中的有效成分与药理作用,结合临床,根据有效成分理化性质,选择适宜的溶剂和提取方法,设计合理的工艺路线,充分考虑可能影响提取效果的因子,进行科学、