棉花根圈细菌绿针假单胞菌pseudom缩影对烟草疫霉的拮抗作用

棉花根圈细菌绿针假单胞菌pseudom缩影对烟草疫霉的拮抗作用

植物根环是一个生活在植物根环中、与植物密切相关的微生物。它可以通过各种机制（如铁载体、与原微生物竞争营养和生态位、抗生素、植物疾病、寄生虫和致病性微生物）来控制植物根的生存。减少或预防和控制对植物病害的植物损失。利用植物根圈拮抗细菌防治植物真菌病害是一个很有发展潜力的方向。土壤微生物研究者和植保工作者已在这方面做了大量工作,目前已从很多作物根圈分离到这类细菌,主要分布在Agrobacterium、Bacillus和Pseudomonas等属。拮抗细菌能在植物根圈定殖是发挥其防病作用的前提,而采用传统的研究方法不能跟踪接入土壤之细菌因而难以得到准确的结果。在微生物生态学研究中,采用发光酶基因标记技术跟踪目标菌,是一种有效的方法,因而被广泛应用。烟草黑胫病(tobaccoblackshank)是由烟草疫霉(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)引起的一种土传性真菌病害,是世界烟草的严重病害之一。对其防治措施主要有:选育、推广抗病品种,合理轮作,药剂防治等。在生物防治方面,除Chen等[91、Handelsman等分别报道过1株BacilluscereusCW85,在烟草幼苗生物测定实验中能抑制P.parasitica游动孢子对烟草幼苗的侵染外,还没发现能防治该病害的生防菌。笔者利用离体拮抗试验和烟草幼苗生物测定法研究了绿针假单孢菌PseudomonascholoraphisPL9对烟草疫霉的拮抗作用及其机理,用全套发光酶基因(Tn7-luxCDABE)标记绿针假单孢菌PL9L菌株以跟踪该菌株在烟草根圈的定殖动态,为根圈拮抗细菌在生物防治植物病害方面提供依据。1材料和方法1.1表达ppla9l和pl9l的表达对菌株的分离和鉴定1)绿针假单胞菌(Pseudomonascholororaphis)PL9由华中农业大学土壤微生物研究室分离自棉花根圈土壤,带有Tn7-luxCDABE全套发光酶基因标记的PL9L菌株由该室构建,抗链霉素、卡那霉素。2)烟草疫霉pn971-2菌株(Phytophthoraparasiticavar.nicotianaepn971-2),由云南省农业科学院戴陆元老师提供。保存方法参见文献。1.3试验草品种CN89,由山东农业大学刘开启老师提供。1.4离体阻力试验参见文献。1.5p.9对p.parasida游泳活性的抑制参见文献。1.6测定根圈土壤pl9l1)无菌塑料瓶栽培系统设置。参见文献。2)处理设置。取30～40日龄的烟草幼苗进行移栽,共设2个处理:无菌对照,浸无菌水,接无菌土;PL9L处理,浸PL9L菌悬液,接无菌土;每个处理15个重复。3)根圈土壤取样。移栽30d后开始取样,每10d取1次。取样时,分段取样,自下而上,将根系分为3部分:上段,茎基部至5cm处;中段,5～11cm处;下段,余下部分。4)PL9L定殖密度检测。采用稀释平板计数法测发光菌落数:称取根圈土壤样品,10倍系列稀释,吸取适宜稀释度的稀释液0.1ml,涂Km+SmKB平板,28℃,培养36h。在暗室内计数发光菌落数,根据稀释度计算样品中PL9L数量。1.7统计分析采用ANOVA(新复极差测验)的LSD测验进行显著性差异分析。2结果与分析2.1液体培养基对p.parasintica的抑制作用1)在燕麦琼脂平板拮抗试验中,28℃培养3d时,PL9菌块对P.parasitica菌丝体的生长有很强的抑制作用,形成了明显的抑菌圈,PL9菌落仅局限在菌块上,没有扩展到周围燕麦培养基上,100倍显微镜检查在抑菌圈内没有发现P.parasitica菌丝体,这说明PL9菌体和P.parasitica菌丝体没有直接接触,抑制作用持续时间长(15d以后,抑菌圈没有明显的缩小)。2)液体混合培养拮抗试验中,在燕麦培养液中28℃下混合培养7d后,各处理中P.parasitica菌丝体干重见图1。从图1中可以看出,混合培养条件下,与对照相比,PL9可显著减轻P.parasitica的菌丝体重量,即在液体混合培养条件下,PL9对P.parasitica有明显抑制作用。3)Microtat96孔微孔板烟草幼苗生物测定试验结果表明,单接种PL9和双接种PL9与P.parasitica游动孢子的处理中的烟草幼苗生长情况与对照处理中的烟草幼苗相比没有明显差异,说明PL9菌株对烟草幼苗的生长没有影响。在单接种P.parasitica游动孢子的处理中的烟草幼苗上可以检测到大量P.parasitica菌丝和游动孢子,而在双接种PL9和P.parasitica游动孢子的处理中烟草幼苗则检测不到(图2),这说明PL9菌株可完全抑制P.parasitica游动孢子对7日龄烟草幼苗的侵染。2.2不同处理对烟草幼苗生长的影响管碟法平板拮抗试验中,PL9的KB浓缩过滤液对P.parasitica有很强抑制作用并有抑菌圈形成,其加铁(不产铁载体)和限铁培养物浓缩过滤液(产铁载体)之间对P.parasitica的抑制效果无明显差异,但没有KB培养物浓缩过滤液的抑制效果强。而且,KB培养物浓缩过滤液和其菌体细胞及加铁、限铁培养物浓缩过滤液一样,在微孔板7日龄烟草幼苗生物测定试验中可以完全抑制P.parasitica游动孢子对烟苗的侵染(图2),延长培养时间到7d时仍观察不到P.parasitica菌丝,而仅接种P.parasitica游动孢子的处理中,在培养72h时所有烟草幼苗上就有大量菌丝和游动孢子囊出现并有游动孢子释放。这说明PL9菌株对P.parasitica游动孢子的拮抗作用可能与抗生素类物质的产生有关,而与PL9分泌的铁载体可能无关。诱导抗性试验结果见图3。从图3中可以看出,各处理中SA(salicylicacid,水杨酸)处理的烟苗病情比对照的显著严重,说明SA处理的烟草可能不能诱发烟草的抗性;PL9处理中烟苗均没发病,说明PL9可能诱发了烟草的抗性。2.3烟草根圈的数量在塑料瓶栽培系统中,经发光菌落平板计数法检测,在烟草根圈土壤的不同部位的PL9L菌株数量见图4。从图4可以看出,PL9L数量在接种PL9L的烟草根圈上段(0～5cm)和中段(5～11cm)均于移栽40d后达到最大值(分别为8.85和6.65Logcfu/g),然后逐渐下降,在下段(11cm以下)则是在50d时才达到最大值(3.81Logcfu/g),然后下降。在整个根圈内其数量呈现出从根圈基部向根圈下部递减的变化。以上结果说明,PL9L菌株可以在烟草根圈成功定殖。3pl9菌株对烟草黑经营病的生物活性本研究发现分离自棉花根圈土壤的绿针假单胞菌PL9菌株既能抑制P.parasitica菌丝体在燕麦琼脂平板上的生长又能在烟草幼苗水培法试验中抑制P.parasitica游动孢子对烟苗的侵染。PL9菌株对P.parasitica菌丝体和游动孢子都有很强的抑制作用,这说明该菌株可能抑制P.parasitica菌丝体和游动孢子对烟草的侵染,而定殖研究结果也表明,PL9L菌株可以在烟草根圈成功定殖。研究结果说明,PL9菌株对烟草黑胫病的生物防治作用有一定的潜力。拮抗机理研究结果表明,PL9对P.parasitica的拮抗作用可能与其产生的对P.parasitica有抑制作用的代谢产物有关,这种代谢产物的物质结构和对P.parasitica的抑制作用机理还需要进一步的研究。