水牛角热提液的生物活性评价研究

水牛角热提液的生物活性评价研究

conububali是牛科动物bubali和科林动物的角。性味苦、寒,具清热、解毒、凉血、定惊作用,临床用于温病高热、神昏谵语、发斑发疹、吐血衄血、惊风癫狂等症,疗效显著。现代研究表明,水牛角水煎液能协同戊巴比妥钠延长小鼠睡眠时间,且具有明显的解热作用。水牛角水解物具有快速止血作用。20世纪80年代,为寻找犀、广角替代资源,国家行业部门对多种角类进行了比较性研究与评价,结果认为水牛角具有相似和确切的功效,并确定了以水牛角之管状部分磅片、水煎、取煎液浓缩后加入经微粉化的角尖粉混合制粒得“水牛角浓缩粉”,收载入中华人民共和国药典(1977年版),并代用犀、广角用作医药工业和临床调剂,取得了良好疗效。30年来关于客观反映水牛角功效的物质基础和生物效应关系尚缺少科学系统的评价研究。本课题组在国家科技项目资助下对犀角、广角、羚羊角及其替代资源水牛角、牦牛角等八种角类药材开展了较为系统的与临床功效相关的生物活性和物质基础评价研究,结果发现水牛角的水溶性蛋白及肽类、游离氨基酸、宏微量元素组成与犀、广角相似,仅含量存在一定差异。在此基础上,进一步对水牛角主要药效学进行了评价,并对水牛角解热活性物质基础进行了初步分析。1实验材料1.1r旋转蒸发仪和mc-3l型电脑在线密度仪分析天平(MettlerToledo千分之一电子天平);DW-2型调温电热碗(江苏通州市张芝镇决心化工电器厂);BuchiR200Rotavapor旋转蒸发仪(瑞士);MC-3L型电脑数字式温度计(欧姆龙大连有限公司生产);ZIL-2型程控自主活动箱(中国医学科学院药物研究所);毛细管(华西医科大学仪器厂生产,内径0.9~1.1mm,壁厚0.10~0.15mm);AmershamAKTABasicPH/C100层析系统(美国通用);BeckmanAllegra64RCentrifuge高速冷冻离心机(美国);Millipore-Q纯水器(美国);VirTis冷冻干燥机(美国)。1.2化学试剂及试剂水牛角购于淮安市码头镇屠宰场,经段金廒博士鉴定为为牛科动物水牛BubalusbubalisLinnaeus的角),符合2005版《中华人民共和国药典》项下标准。艾司唑仑片(常州四药制药有限公司,白色片剂,1mg/片);氨甲苯酸片(国营张家港市制药厂,白色片剂,0.25g/片);阿司匹林肠溶片(南京白敬宇制药有限公司);干酵母(湖北安琪酵母股份有限公司生产);考马斯亮蓝G-250(国药集团化学试剂有限公);牛血清白蛋白对照品(国药集团化学试剂有限公司)。1.3动物小鼠(KM种,上海斯莱克实验动物有限责任公司);大鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)。2实验方法2.1样品的制备2.1.1牛角粉的制备水牛角晒干后除去角塞,经江苏省盱眙县中药饮片厂加工粉碎后过400目筛,得水牛角粉。2.1.2提取水牛角热提液制备水牛角热提液制备水牛角热提液制备水牛角热提液制备水牛角热提液制备水牛角热提液见表2称取水牛角粉适量,加蒸馏水回流微沸提取3次,第1次加14倍量水提取10h,第2次加12倍量水提取8h,第3次加12倍量水提取6h,提取液合并后60℃旋转蒸发至0.55g(生药)/mL,得水牛角热提液,置4℃保存备用,经考马斯亮蓝法测定其中蛋白质含量约为3.213mg/mL。2.1.3蛋白质含量测定称取水牛角粉适量,加蒸馏水4℃搅拌冷浸3次,每次加10倍量水冷浸8h,冷浸液合并后55℃旋转蒸发至0.55g(生药)/mL,得水牛角冷浸液,置4℃保存备用,经考马斯亮蓝法测定其中蛋白质含量约为0.266mg/mL。2.2牛角综合药物评价的实验2.2.1大鼠的前测模型选健康大鼠,雄性,体重180~200g,编号,称重。测肛温2次,选用40只体温范围36~38.5℃,且体温波动小于0.3℃者,随机分为5组,分别为空白对照组、热提液组、冷浸液组、水牛角粉组、阳性药组(阿司匹林片),每组8只。造模前测体温作为“基础体温”。大鼠的剂量为:2.75g(生药)/kg。各组大鼠均背部皮下注射20%酵母-NS溶液10mL/kg,造成发热模型。造模后6h,每组大鼠均分别灌胃给药,给药后的0、0.5、1、1.5、2、3h复测大鼠肛温。以各时间点的体温升高值作组间比较,实验结果数据以平均值±标准偏差表示。2.2.2小鼠的分组及用量取小鼠50只,禁食12h,体重20g左右,分为5组,分别为空白对照组、热提液组、冷浸液组、水牛角粉组、阳性药组(艾司唑仑片),每组10只,雌雄各半。小鼠的剂量为:5.5g(生药)/kg。每只小鼠在程控自主活动箱放置1min后,记录其2min内的活动次数。2.2.3动物分组及剂量取小鼠50只,禁食12h,体重20g左右,分成5组,分别为空白对照组、热提液组、冷浸液组、水牛角粉组、阳性药组(氨苯甲酸片),每组10只,雌雄各半。小鼠的剂量为:5.5g(生药)/kg。连续对小鼠灌胃给药3d,d3给药1h后,用毛细管插入小鼠内眦球后静脉丛取血,达5cm血柱,每隔15s折断毛细管一小截,检查有无血凝丝出现,记录从毛细管采血到出现血凝丝的时间,为凝血时间。2.3牛角热提取物的热激活部位筛选试验2.3.1角热提液剂量组1.0g采用大鼠解热实验,将选取的健康大鼠随机分为5组,分别为空白对照组、水牛角热提液低剂量组(1.1g生药/mL)、水牛角热提液中剂量组(2.2g生药/mL)、水牛角热提液高剂量组(4.4g生药/mL)和水牛角粉组。以各时间点的体温升高值作组间比较,实验结果数据以平均值±标准偏差表示。2.3.2a合成ph/c100层析系统凝胶柱层析法:SephadexG25柱(40cm×2.8cm),AKTABasicPH/C100层析系统,水为流动相,流速2mL/min,紫外检测器在215nm,260nm,280nm处检测。用该法将水牛角热提液分离为A、B、C3个部位,并通过凝胶电泳实验测定3个部位的相对分子量范围。2.3.3水牛角热提液的热提液热提液样品的制备采用大鼠解热实验,将选取的健康大鼠随机分为5组,分别为空白对照组、水牛角热提液A部位、B部位、C部位、阳性药组(阿司匹林片),剂量采用热提液解热最佳剂量。以各时间点的体温绝对值和体温升高值作组间比较,实验结果数据以平均值±标准偏差表示。3结果3.1牛角综合分析的实验结果3.1.1热提液和冷浸液给药后的热作用表1结果表明水牛角粉在给药后1h(P<0.05),1.5h(P<0.01)有解热作用,热提液在给药后1.5h(P<0.05)有解热作用,而冷浸液给药后3h内无明显解热作用。分析结果发现,同等剂量下,水牛角粉的解热作用最强,水牛角热提液的解热作用次之,而冷浸液的解热作用不确切。3.1.2水牛角粉、热提液、冷浸液给药前后自发活动次数结果见表2。由表2可看出水牛角粉、热提液、冷浸液给药后小鼠自发活动次数与对照组比较无显著性差异(P>0.05),而水牛角粉、热提液、冷浸液给药前后自发活动次数减少值与对照组比较有显著性差异(P<0.05),从以上结果看出,水牛角粉、热提液、冷浸液均具有良好的镇静作用。3.1.3小鼠出血时间和凝血作用结果见表3。表3结果表明水牛角粉、热提液、冷浸液均能缩短小鼠出血时间,具有显著的凝血作用,而水牛角粉和热提液的凝血作用(P<0.01)强于冷浸液的凝血作用(P<0.05)。3.2实验结果3.2.1水牛角热提液给药后体温增增率ld50由表4可看出,水牛角热提液低剂量组(1.1g生药/mL)给药后体温增减值在0.5、1.5、2h与空白组比有较显著性差异(P<0.01,P<0.05);水牛角热提液中剂量组(2.2g生药/mL)给药后体温增减值在0.5、1、1.5、3h与空白组比有较显著性差异(P<0.01,P<0.05);水牛角热提液高剂量组(4.4g生药/mL)给药后体温增减值在0.5、1、1.5、3h与空白组比有较显著性差异(P<0.01)。根据解热作用持续时间和体温降低幅度值确定,水牛角中剂量为解热最佳剂量。3.2.2相对分子量范围按照分子量大小将水牛角热提液分为A部位、B部位和C部位,分别表示大分子量部位、中分子量部位和小分子量部位,相对分子量范围分别为4100Da~10kDa、3700Da~6500Da与3500Da~5800Da。3.2.3水牛角热提液a部位对大鼠体温的影响结果见表5、表6。表5、表6结果表明,水牛角热提液C部位给药后2h大鼠体温绝对值与对照组比较有显著性差异(P<0.05);水牛角热提液A部位给药后1h、1.5h、3h大鼠体温增减值与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。分析结果表明,水牛角热提液A部位和C部位具有解热作用。4水牛角的基础研究本文对水牛角药儿学评价研究结果表明水牛角粉、水牛角热提液具有显著的解热、镇静、促凝血活性;冷浸液解热作用不明显。据文献分析可知,水牛解中所含特殊氨基酸如牛磺酸、谷氨酸等可能与镇静、凝血活性相关;所含微量元素如Ca2+、Mg2+可能与镇静、解热活性相关。水牛角热提液解热活性评价与物质基础研究表明,水牛角热提液中大分子量部位与小分子量部位活性显著,其分子量范围介于3500Da~10kDa之间,提示主要成分可能为对热稳定的多肽、氨基酸等物质,其进一步分离纯化、活血性追踪及作用机制的单明有待深入研究。同时,利用生物技术克隆具有生物活性的蛋白及多肽物质也是具有发展前景的方向之一。水牛角的中医临床传统功效之一为清热凉血,本文药效学评价表明水牛角具有显著的促凝血活性,但促凝血的效应指标是否体现