木霉菌对甜瓜枯萎病的田间防效及防御酶系比的影响

木霉菌对甜瓜枯萎病的田间防效及防御酶系比的影响

近年来，随着种植结构的调整，保护和塑料大阀的面积也在增加。作为一种土壤传统病，瓜氨酸腐烂病逐年恶化。正常年产量损失20%30%，严重年平均产量几乎无效，已成为瓜氨酸生产的常见病。目前，对瓜类枯萎病的防治主要采用以嫁接防病为主，辅以化学防治，但甜瓜枯萎病菌以菌丝和孢子在土壤中越冬，其厚垣孢子在土壤中存活年限较长，且枯萎病菌一旦进入植株体内药剂防治相当困难。随着人们生态意识的不断提高，对绿色食品、无公害产品的需求也越来越多。木霉菌以其繁殖速度快，适用性强，成为生物防治的热点，国内外已有报道,但对其防治机理研究的不多。本实验室多年来对木霉菌防治瓜类枯萎病进行大量研究，本试验即在此基础上，对木霉菌防治甜瓜枯萎病的机理进行研究，为木霉菌的生物防治提供理论基础。1材料和方法1.1木霉菌s13供试甜瓜品种为改良齐甜一号。生防菌株为木霉菌T23，由沈阳农业大学生物农药工程中心提供。甜瓜枯萎病菌菌株-尖孢镰孢菌分离自辽宁省锦州市太河区甜瓜枯萎病株。1.2防雨效果测定1.2.1接种菌培养物镰刀菌放在玉米砂培养基中培养14d，木霉菌放在麦麸培养基中培养7d，风干后粉碎备用。将木霉菌培养物与无菌土以1∶100比例混合，镰刀菌培养物以0.5∶100混合，设接种镰刀菌、同时接种木霉菌和镰刀菌、不接菌（为对照）3个处理。每个处理3次重复。甜瓜种子经表面消毒催芽后播种于直径10cm的塑料盆中，每个处理50盆，每盆2粒种子，放置在玻璃温室内，于三叶期调查发病率。1.2.2木霉菌基土处理在甜瓜苗定殖期，将木霉菌培养物与田间土以1∶400比例混合，每穴施用100g，于甜瓜开花期再用水将木霉菌培养物稀释500倍，每穴100mL灌根，以不拌药和化学农药苗菌敌(30%多·福可湿性粉剂，齐齐哈尔四友化工有限公司生产)1∶50拌土穴施作为对照。每个处理随机种植3个小区，每小区6行，每行15株。于果实膨大期调查发病率。1.3防御反应酶系统的测定1.3.1木霉菌对土壤中ze甜瓜种子经55℃温汤浸种30min后催芽，挑选长势一致的发芽种子播种。培养待甜瓜长出3片真叶后，开始接菌。木霉菌的孢子浓度为5×106个·mL-1，镰刀菌的孢子浓度为1×106个·mL-1。将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤，每穴10mL。共分4个处理：(1)只接镰刀菌(F)；(2)接种木霉菌T23(T)；(3)先接种木霉菌T23,3d后接种镰刀菌(T+F)；(4)不接菌（CK）。从接种前开始隔天取样，直至接种后第7天。取根部样品，自来水强力冲洗后，用滤纸吸干，装入自封袋，放入-20℃低温冰箱中保存。1.3.2酶的粗提取液的制备准确称取1g甜瓜根样品，放入预冷的研钵中，加入1.5mL0.2M硼酸缓冲液（pH值8.8）及0.2g石英砂，冰浴中研磨成匀浆，转移至离心管中，用1.5mL上述缓冲液冲洗研钵及钵棒2次合并入离心管，搅动20min后，10000r·min-1,离心20min，上清液即为酶的粗提取液。1.3.3酶活性的测定苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶活性测定：以L-苯丙氨酸为底物，按许勇的方法，以每小时OD值变化0.01为一个酶活单位，用U·g-1FW表示酶活性；过氧化物酶（POD）酶活性测定：以愈创木酚为底物，用陈捷等的方法测定，以每分钟OD值变化0.1为一个酶活单位，用U·g-1FW表示酶活性；多酚氧化酶（PPO）酶活性的测定,以邻苯二酚为底物，按陈捷等的方法测定，以每分钟OD398nm变化0.01为1个酶活单位，用U·g-1FW表示酶活性；β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）比活性以葡聚糖为底物，按汤章城的测定方法，以每秒钟产生还原糖1nmol为1个酶活单位，用U·g-1FW表示酶活性。1.3.4酶提取物及未知样品蛋白含量的测定2结果与分析2.1木霉菌对甘蔗枯萎的预防2.1.1木霉菌对甘蔗枯萎的室内治疗效果从表1可以看出，使用木霉菌处理的甜瓜苗与单独接种镰刀菌处理的相比发病较迟，发病率低，相对防效在70%以上。2.1.2木霉菌对甘蔗枯萎的田间治疗效果从表2可以看出，使用木霉菌可以有效的防治田间甜瓜枯萎病，防治效果明显高于化学农药苗菌敌。2.2酶比活力的测定2.2.1接种木霉菌对3天酶活性的影响如图1所示：接种镰刀菌处理（F），酶活力始终低于空白对照，接种后第1天至第5天酶活力呈下降趋势，第7天时有所回升。接种木霉菌处理（T），第3天酶活性达到峰值，较对照高出55.7%，之后酶活性缓慢下降，第7天接近对照。先接种木霉菌，3d后接种镰刀菌处理（T+F），酶活性形成两个活性高峰，第一个高峰出现在接种后第1天，峰值较低，为1495.14U·g-1FW；随后，酶活性缓慢下降，至第7天形成第二个酶活性高峰，峰值为2515.08U·g-1FW，较对照高出138.7%。可见随着时间的延长，接种木霉菌后再接种镰刀菌能明显诱导PAL酶活性的升高。2.2.2接种木霉菌、木内杆菌活性如图2所示：接种镰刀菌处理（F），第1天至第5天酶活力始终低于空白对照，第3天酶活较对照下降228.6%，第7天形成酶活高峰，峰值为362.58U·g-1FW，高于对照。接种木霉菌处理（T），酶活始终高于空白对照，第3天和7天形成两个酶活性高峰，峰值分别为354.18U·g-1FW和391.2U·g-1FW，稍高于对照。先接种木霉菌，3天后接种镰刀菌处理（T+F），第1天出现第一酶活力高峰，活性明显高于其他处理，峰值为574.62U·g-1FW,是对照的1.9倍，到第3天出现峰谷，之后酶活性缓慢上升，第7天出现第二个高峰，酶活性达到978.84U·g-1FW，是对照的8.87倍。可见，接种木霉菌后再接种镰刀菌的处理，诱导产生的POD酶活性明显高于其他处理。2.2.3接种木霉菌对7天酶活性的影响如图3所示：只接镰刀菌处理（F），第1天出现一个较大的酶活性高峰，峰值为760.85U·g-1FW，是对照的1.73倍，之后急速下降，第3天出现峰谷，酶活性低于对照31.2%，尔后酶活性缓慢上升，第7天出现第二个高峰。接种木霉菌处理（T），第1天出现酶活性高峰，峰值为702.42U·g-1FW，是对照的1.7倍，之后缓慢下降，第5天出现峰谷，第7天酶活性有所回升，再次出现高峰，但值小于第1天时，酶活性接近只接镰刀菌处理。先接种木霉菌，3天后接种镰刀菌处理（T+F），第1天和第5天酶活性稍高于空白对照，第3天出现峰谷，与只接镰刀菌处理持平，之后酶活性开始上升，第7天酶活性上升幅度较大，明显高于其他处理，高于对照183.9%，其峰值为833.1U·g-1FW。由图3中可以看出，接种后第一天，镰刀菌的诱导作用较强，随着时间的延长，接种木霉菌后再接种尖孢镰孢菌的处理的诱导作用呈现上升的趋势。2.2.4不同接种木霉菌、尖孢镰孢菌的酶活性如图4所示：接种镰刀菌处理（F），第5天出现一个明显的酶活性高峰，峰值为36.11U·g-1FW。接种木霉菌处理（T），第3天出现一个小峰，峰值为47.22U·g-1FW，第7天达到酶活性高峰（64.33U·g-1FW），是对照的2.46倍。先接种木霉菌再接种尖孢镰孢菌的处理（T+F），酶活性呈逐渐上升的趋势，峰值较低，为46.39U·g-1FW，是对照的1.59倍。由图4中可以看出，接种木霉菌后再挑战接种镰刀菌的处理和单独接种木霉菌的处理均能明显诱导β-1,3-葡聚糖酶活性的增强。3结论和讨论3.1木霉菌在甜瓜枯涣病治疗中的应用应用木霉菌对土传病害的研究国内外虽有很多报道，但在实际应用过程中防治效果都不是十分理想。本研究利用木霉菌T23防治甜瓜枯萎病的相对防治效果达到79.00%，主要是选择了木霉菌用于生物防治的最适使用方法及使用量，为木霉菌生存及定殖提供理想的环境条件，进而在其与病菌竞争中处于优势地位。本研究证实将木霉菌通过穴施和灌根相结合的方法施用，对枯萎病可取得理想的防效。3.2木霉菌对植物致病性的影响植物受到病原物侵染后，其反应相当复杂，植物-病原物的互作或者植物对病原物入侵生理反应的最基本原因是酶的催化作用。PAL是酚类物质、植保素和木质素合成的关键酶，植物在受到病原菌侵染或激发子刺激后PAL活性会首先上升。POD催化脂肪族、芳香族和酚类物质的氧化，是木质素合成的关键酶之一，其活性的增加，标志着木质素的加速合成和植物抗性的产生。PPO能将酚类物质氧化成对病菌有毒的醌类物质。几丁质是植物病原菌细胞壁的主要成分之一，在体外病原和非病原真菌生长尤其是菌丝尖部最易受到几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的降解。因此，通过研究寄主防御酶系的活性变化可间接反应植物的抗病性水平。本研究结果表明：先接种木霉菌再接种镰刀菌处理的PAL、POD、PPO酶活性显著高于其他处理，且变化趋势基本相同，第1天出现一个酶活性小高峰，第7天达到酶活性高峰，这与前人的研究结果相一致。在防御酶活性的增长速度上，从第5天迅速上升，到第7天达到峰值。其原因可能是木霉菌处理甜瓜后激活了寄主植物防御酶系或对植物起到敏化作用，当接种病原菌后，进一步激发了防御酶的防卫反应，从而酶的活性明显高于其他处理。当然，这种类似于协同的激发作用很复杂，并不是一个简单的叠加作用。β-1,3-葡聚糖酶