木霉菌株ri2发酵液对南方根结线虫病的田间防治效果

木霉菌株ri2发酵液对南方根结线虫病的田间防治效果

0木霉菌防治根结线虫的研究进展根结线虫（meloidold.）的采样能力超过3000种。这是设施农业生产中常见的人为障碍和灾难之一。根结线虫对作物的产量损失一般为20%左右,严重时减产30%~40%,甚至绝收。由于栽培黄瓜中未发现抗南方根结线虫的种质资源,在生产中化学防治仍然是防治根结线虫的重要措施,但是大量且重复性使用化学杀线剂会严重污染环境,威胁农业生产及人类的安全,因此生物防治日益受到人们的重视。现在,国内外都有一些商品化的生防制剂用于防治根结线虫。木霉菌(Trichodermaspp.)属于半知菌门丝孢目木霉属,广泛存在于不同环境条件下的土壤中,是非常有用的丝状真菌,在农业生产中发挥着重要作用。常见的木霉有绿色木霉、康宁木霉、棘孢木霉、深绿木霉、哈茨木霉、长枝木霉等。在大约80年前,人们就发现木霉菌具有控制植物病害的作用,可产生多种对植物病原真菌、细菌及昆虫具有拮抗作用的生物活性物质,比如细胞壁降解酶类和次级代谢产物,并能提高农作物的抗逆性、促进植物生长和提高农产品产量,因此被广泛用于生物防治。木霉菌是防治植物寄生性线虫的生防资源,国内外相关报道证实,木霉菌可以寄生根结线虫的卵,发酵液可以杀死根结线虫二龄幼虫(J2),减少根结数量。但是应用木霉菌防治根结线虫的研究仍然很少,为了进一步挖掘木霉菌防治根结线虫的资源,特别是哈茨木霉菌资源,笔者从土壤中分离并筛选了木霉菌株TRI2,进行了种类鉴定。采用TRI2发酵液对南方根结线虫J2进行致死效应分析,并以黄瓜为供试作物,在温室盆栽及大田中进一步确定了菌株TRI2对黄瓜根结线虫的防治效果,为开发新型、高效的木霉菌杀线剂及合理应用奠定基础。1材料和方法1.1土壤的利用黄瓜(CucumissativusL.)‘9930’种子由中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组提供,用于盆栽试验及田间试验。木霉菌TRI2采用稀释分离法分离自北京顺义温室菜田土壤,由本所病害实验室进行单孢纯化用于试验。南方根结线虫(Meloidogyneincognita)采自北京海淀区四季青农场,并在温室中在感病的‘茄门’辣椒(Capsicumannuum)上进行单卵块繁殖,将辣椒根系取出,用水轻轻冲洗,取下卵块,置于1%的次氯酸钠中消毒3min,再用无菌水冲洗3次,放入内有少量无菌水的培养皿中,25℃恒温孵化,每隔24h收集一次J2,收集的线虫用于室内杀线虫试验及温室盆栽接种试验。根结线虫田间防效试验于2013年8—11月在河北昌黎蔬菜生产基地进行,化学药剂1.8%的阿维菌素购于市场。1.2来自特记住特记住昆虫2的疾病1.2.1形态鉴定方法将木霉菌株进行单孢分离后,接种到PDA培养基上观察菌落颜色、形态及培养性状,挑取菌丝,在显微镜下观察菌丝及孢子特征,根据培养性状按照Rifai和Bissett的分类方法进行形态学鉴定。1.2.2pcr扩增及产物检测将单孢纯化的木霉菌株TRI2,采用PDA液体培养基进行震荡培养5天(28℃,180r/min),收集菌丝及孢子,采用CTAB方法提取DNA,以DNA为模板,用引物ITS1、ITS4和EF1H、EF2T分别进行ITS和tef1序列扩增,PCR扩增程序分别为:95℃4min,1个循环;95℃30s;55℃30s;72℃50s,35个循环,72℃延伸10min,10℃保存1h。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。将DNA片段进行切胶回收,进行测序(三博远志公司),并将序列提交NCBI(),进行BLAST序列比对,在分子水平鉴定菌株的种类。1.3木霉tri2对黄瓜根结线虫的预防1.3.1接种根结线虫及接种苗子培养当黄瓜第1片真叶完全展开时接种南方根结线虫。接种时在距离黄瓜根2cm处的基质中均匀打3个1cm深的小孔,注入线虫悬浮液,每株接种根结线虫600条,每个处理接种苗子10株,处理重复3次,并且以清水模拟接种为对照,盆栽试验重复3次。接种后苗子在温室中进行正常管理,在接种根结线虫45天时,观察根部症状,检测根结,统计根结数量,计算根结减退率[式(2)],并用SAS9.1采用t测验对结果进行方差分析。2结果与分析2.1分生孢子组织形态观察菌株生长迅速,在PDA培养基上25℃培养2天,菌落长满直径5cm的培养皿,菌落圆形,菌丝白色,气生菌丝较繁茂且呈现为棉絮状,边缘气生菌丝较少,在5~7天菌落渐变为绿色,最后变为暗绿色,产生大量的绿色分生孢子,但菌落中仍然具有气生菌丝,菌落背面变为深黄色(图1F)。菌落气味不明显。在显微镜观察发现,菌丝透明,有隔,初级分枝有规律地间隔,与主枝常近直角略向上弯曲通常成对或3个轮状排列(图1A),分生孢子梗多对生或轮生,呈塔状结构(图1B)。分生孢子梗呈瓶状,长约20μm多数以2或3~5个轮状排列(图1A),分生孢子近球形至倒卵形,(2.5~3.3)μm×(2.3~3.0)μm,孢子壁光滑,浅绿色(图1C)。菌株TRI2的培养性状及形态特征与哈茨木霉Trichodermaharzianum基本一致。2.2整株鉴定—木霉菌菌株TRI2的分子生物学鉴定以菌株TRI2的DNA为模板,用引物ITS1、ITS4和EF1H、EF2T分别扩增获得ITS和tef1片段(图2),长度分别为574、880bp。将测定序列在NCBI数据库中进行blast同源性搜索,发现ITS片段与Hypocrealixii菌株(Trichodermaharzianum有性世代)ITS序列JX088246.1相似性达到100%,tef1片段与Hypocrealixii菌株的tef1a序列AY605732.1、AY605770.1的相似性达到98%,结合TRI2培养性状和形态特征,将TRI2鉴定为哈茨木霉Trichodermaharzianum。2.3木霉tri2对黄瓜根结线虫的预防2.3.1线虫活性和抗菌材料活性检测发酵液处理根结线虫后,在12h内线虫几乎没有变化,随时间延长发酵液对线虫的校正死亡率明显增加,在36h时发酵液对根结线虫击倒率接近100%,线虫体呈现为略有弧度的僵直状,但是将线虫转移到2%盐水中,在体视显微镜下用竹针轻轻拨动,大约有15%~35%的线虫能够恢复活性,呈现为缓慢的蠕动。在48h内线虫的校正死亡率达到100%(图3),此时只有极少数的线虫可以恢复活性(图4B),在60h时所有线虫全部死亡,不能恢复活性(图4C)。对照在60h内死亡率没有显著变化(图4A)。2.3.2根结数量的显著性t测验在接种南方根结线虫45天后,调查根结情况,发现在木霉菌TRI2处理中根结小而少(图5TRI2),3次试验中根结数量为83.9、93.1、76.0个/株,平均为85.3个/株,而在清水对照中根结数量多且根结大(图5CK),3次试验中根结数量分别达到了243.3、229.7、227.1个/株,平均为233.4个/株。采用SAS9.1软件对处理与对照的根结数量进行方差显著性t测验分析,证实标准差为33320.8,F值为448.24,Pr>F值(P<0.0001),说明处理与对照植株上的根结数量存在着极显著差异(图6)。按根结减退率公式计算,TRI2对黄瓜根结减退率达到63.5%,结果表明菌株TRI2对黄瓜南方根结线虫具有一定的防治效果。2.3.3阿维菌素对黄瓜根系生长情况的影响在温室大棚中,在黄瓜植株处理60天后,将黄瓜根系挖出,轻轻抖掉根际土壤,根据病情级别标准确定根结线虫发病情况。其中,对照黄瓜根结症状明显,根结数量特别多,根结覆盖面积所占全根系达到76%~100%,81%的植株病情级别达到了4级(图7A),通过根结指数计算公式,3次试验中,对照的平均根结指数分别达到了93.18、97.73和95.45。在木霉菌处理中,黄瓜根系上只有少量根结,且根结小,根结覆盖面占全根系1%~25%(图7B),90%的植株病情级别小于等于1,平均病情级别为1.07,3次试验中,木霉菌的平均根结指数分别达到了27.27、27.27和25.00。而在阿维菌素处理中,黄瓜根系上根结少且小,根结覆盖面小于25%(图7C),76%的植株病情级别小于等于1,平均病情级别为1.15,3次试验中根结指数达到34.09、22.73和29.55。通过防效公式计算,木霉菌的防治效果分别达到了71.4%、71.4%、73.8%,平均为72.2%(图8);而阿维菌素的防治效果分别达到了64.3%、76.2%、69.0%,平均为69.9%(图8)。采用SAS9.1软件对3次试验的防治效果进行方差分析,证实标准方差为8.16,F值为0.43,Pr>F的值为0.5467(P>0.05),方差分析说明虽然木霉菌TRI2的防治效果略高于阿维菌素,但是2个处理在防治效果上没有显著差别。TRI2的田间试验效果再次说明木霉菌TRI2对根结线虫具有较好的防治效果。3哈茨木霉菌株对根结线虫的防治效果本研究通过形态学观察,并结合分子生物学ITS、tef1序列分析方法鉴定了哈茨木霉菌株,这在木霉菌株的鉴定方面有很高的准确度。另外从室内发酵液、温室盆栽和田间试验3个方面逐步深入研究了哈茨木霉菌株TRI2对根结线虫的防治效果,在室内哈茨木霉菌株TRI2的发酵液杀死J2的效果很明显,在温室盆栽和田间试验中取得了较好的防治效果,这为生产上木霉生物制剂的开发和利用奠定了一定的基础。研究结果对进一步的研究哈茨木霉菌株TRI2与根结线虫的互作机制以及该菌株产生的次级代谢产物提供了依据。4木霉菌对根结线虫的防治效果木霉菌在农业生产中发挥着重要的作用,它们可以产生大量的水解酶,木霉菌中分离到的相关酶的基因已经用于改善作物对病原物的抗性。木霉菌可以产生大量的次生代谢产物,对植物病原具有防控作用,同时还可以对作物(黄瓜)产生诱导抗性。木霉菌可以增加植物的基本免疫反应(PTI)和效应子引发的免疫反应(ETI),同时,木霉菌可以促进作物的生长。木霉菌作为一种典型的生防制剂已经在世界范围60多个国家广泛应用,主要应用于蔬菜、观赏作物及大田作物。一些木霉菌的商品及制剂已经在欧洲及南美洲应用,但是由于木霉菌的遗传多样性,其在农业生产中的作用远远没有充分利用。木霉菌用于线虫病害生物防治方面的研究在国内外的报道都较少,特别是防治根结线虫的研究。但是很早就发现哈茨木霉可以产生几丁质酶从而抑制根结线虫卵的孵化,而且有些木霉菌对根结线虫具有较高的防治效果。在国内已经报道分离到许多对根结线虫具有防治效果的生防菌菌株,并且研究了哈茨木霉菌菌株Snef85及绿色木霉对根结线虫的具有很高的致死作用,长枝木霉防治南方根结线虫的致死效应及寄生作用亦得到证实,应用木霉菌防治根结线虫日益受到人们的重视。通过研究,笔者分离到了哈茨木霉菌TRI2,并通过室内生测、温室盆栽及田间试验等确定了其对根结线虫具有较好的防治效果,这些研究结果与国内外的研究结果相似,特别是在田间试验中,TRI2表现出较高的防效,这将为进一步深入研究TRI2菌株及菌剂的商品化奠定坚实的基础。另外,木霉菌TRI2处理后对黄瓜株高、产量及土壤中根结线虫的影响仍然需要进一步深入研究。虽然,一些木霉菌可显著提高植物的生活力,延长结实期,但关于木霉防治根结线虫的作用机制尚不清楚,原因可能是多方面的。木霉菌的生防机制涉及拮抗作用、竞争作用、重寄生作用、诱导植物抗性、促生作用等多个方面。现在木霉菌的3个种T.reesei、T.atroviride、T.virens已经完成了全基因的测序工作,这将为深入研究木霉菌对根结线虫的作用机制提供重要平台。通过试验笔者发现TRI2的发酵液对根结线虫具有致死作用,说明菌株在代谢过程中产生了能够杀死线虫的物质,而在盆栽试验及田间试验中仍然具有较高的防治效果,说明TRI2菌株很可能存在着诱导植物抗性、重寄生作用等。因此TRI2对根结线虫的作用机制、产生的杀线虫代谢活性物质的分离纯化、高效菌剂的研制及改良等问题均有待于进一步研究。将菌株TRI2接种于查氏培养基(NaNO32.0g、K2HPO41.0g、KCl0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO40.01g、蔗糖30.0g、蒸馏水1000mL),于25℃液体摇瓶发酵7天。发酵液抽滤出菌丝,并通过12000r/min离心15min除去孢子后,将发酵液用于室内杀线虫试验。将200μL发酵原液分别加入到48孔细胞培养板中,并且每孔加入200条J2,以清水作为对照,重复3次试验。分别在2、12、24、36、48、60h观察线虫死亡情况,将虫体僵直的J2再次分离后置于盛有2%盐水的培养皿中,在体视显微镜下用竹针轻轻拨动J2,静止不动的即为死亡个体。根据式(1)计算线虫的校正死亡率。1.3.2黄瓜种子培养将菌株TRI2接种于查氏培养基,25液体摇瓶发酵培养大约7~10天,当木霉菌孢子浓度达到2×107个/mL时,将灭菌基质(草炭:蛭石=2:1,V/V)与发酵液进行充分混合作为培养介质用于温室盆栽接种试验,发酵液接入量为每千克基质加入100mL菌液。将黄瓜‘9930’种子用5%的NaClO消毒10min,用无菌水清洗干净后28℃催芽1天,播种于72孔穴盘中,在25~28℃温室中培养。当黄瓜苗达到2叶1心期时将苗子转移到苗钵中(直径10cm,高15cm),每钵使用混合基质约150g。1.3.3灌根、分离、种植将菌株TRI2接种于查氏培养基,25℃液体摇瓶发酵培养大约10天,当木霉菌孢子浓度达到2×107个/mL时,将木霉菌发酵液与灭菌育苗基质进行充分混匀作为菌剂用于田间试验,混合比例为每千克基质加入300mL发酵液。当黄瓜苗达到2叶1心期时将苗子