甜瓜枯萎病防治反应及相关酶活性的变化

甜瓜枯萎病防治反应及相关酶活性的变化

土壤养殖的风险和南瓜萎缩，对生产和工业的危害十分严重。木霉(Trichodermaspp.)是一类普遍存在、已被广泛应用的生防因子。它能对多种病原菌产生拮抗作用,有效地抑制病原菌生长。植物内生细菌由于定殖于宿主体内,有充足的营养来源,不易受外界逆境因子影响,与其它根际细菌、叶际附生细菌相比,其特定的生存环境更利于发挥生防作用,因而成为近年来倍受人们关注的生防因子。研究者们已经从棉花、马铃薯、辣椒、玉米等植物中分离出大量的内生细菌,并对内生细菌的生防机制作了研究。但有关拮抗木霉和植物内生细菌结合防治的研究却不多见。本试验在温室内应用拮抗内生细菌与木霉复合处理甜瓜,从防御酶系的变化分析其诱导甜瓜抗病性的生防机制。1材料和方法1.1绿色木霉属viruspo型甜瓜品种为“齐甜一号”。枯草芽孢杆菌[Bacillussubtilis(Ehrenberg)Chon(1872)]B6菌株自甜瓜组织内分离,绿色木霉(TrichodermaviridPers.exS.F.Gray)T23、甜瓜枯萎病菌[Fusariumoxysporumf.spmelonis(Leach)Syn]F由沈阳农业大学生物防治工程中心提供。1.2内生细菌多样性测定木霉T23在麦麸培养基(麦麸与水按质量分数约1∶1混合,121℃湿热灭菌45min)中25℃恒温培养10~14d后,风干粉碎,以1∶100比例与灭菌土混合。甜瓜枯萎病菌F在玉米粉砂土培养基(玉米粉1000g,洗净的砂1000g,水1500ml)中25℃培养10~14d,风干粉碎,以0.5∶100与灭菌土混合。内生细菌B6在LB培养液中30℃振荡(120r/min)培养48h,制成浓度约2×107cfu/ml的菌悬液。常规种子消毒处理,待芽长约1cm左右时播种。种子播种在灭菌土中,待甜瓜长出3片真叶后,进行接种。用注射器将菌悬液注入植株根围土壤,单独接种的处理每株接种10ml,复合接种的处理B6与T23各5ml,设清水为对照。试验设:①接种F;②接种F和T23;③接种F和B6;④同时接种T23、B6和F,共4个处理。每处理80盆,每盆播2粒种子,每处理3次重复。放入温度约25℃的温室中培养,三叶期调查记录发病情况。1.3例如，b2和b23的组合使用对瓜氨酸反应反应酶系统的影响1.3.1制备抗血球计数板上的药物T23和病原菌F在PD液体培养基中28℃振荡(120r/min)培养7~10d,血球计数板调整孢子浓度,制成5×106cfu/ml(T23)和1×106cfu/ml(F)的孢子悬液。1.3.2接收点3和s13种子处理和接种方法同1.2。诱导接种后72h挑战接种F菌株,试验共设8个处理:①CK(自来水);②接种T23;③接种B6;④接种T23后,挑战接种F(T23+F);⑤接种B6后,挑战接种F(B6+F);⑥同时接种T23和B6(T23+B6);⑦同时接种T23和B6后,挑战接种F(T23+B6+F);⑧单独接种F。1.3.3不接种、挑战接种f的处理取甜瓜根用自来水快速冲洗后,用滤纸吸干,每个样品称取1g装入自封袋,放入-70℃超低温冰箱中保存。每个处理3次重复取样。不接种F菌株的处理从接种后开始每隔48h取一次样,至接种后的第8d;挑战接种F的处理从接种F菌株后每隔48h取一次样,至挑战接种的第8d。将上述称取的样品,放入预冷的研钵中,加入3ml硼酸缓冲液(含有少量巯基乙醇)和少量石英砂,冰浴研磨成匀浆,转移至离心管中,10000r/min、4℃离心20min,所得上清液即为酶的粗提取液,4℃保存。1.3.4酶法制备酶系统,-1,3-葡聚糖酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)以L-苯丙氨酸为底物,按贾显禄的方法测定,有改动;过氧化物酶(POD)以愈创木酚为底物,参照陈捷等的方法测定;多酚氧化酶(PPO)以邻苯二酚为底物,参照李靖等的方法测定;β-1,3-葡聚糖酶以葡聚糖为底物,按高增贵、贾显禄方法测定。酶粗提液及未知样蛋白含量的测定参照Broadford方法,用考马斯亮蓝G-250法测定酶粗提液中的蛋白含量,以牛血清白蛋白作标准曲线。2结果与分析2.1不同菌株单独和复合处理对抗性相关系数的影响在温室内,B6和T23复合处理对甜瓜枯萎病的相对防效达82.22%,而B6菌株和T23菌株单独处理相对防效分别为61.90%和33.33%,复合处理比单独处理分别高32.8%和146.7%(表)。2.2不同复合接种对甜瓜根系pod活性的影响2.2.1PAL活性T23、B6、T23+B6诱导接种甜瓜幼苗后,PAL活性高于对照,但各处理间差异不大(图1A)。单独接种T23后酶活性逐渐上升,8d峰值达到2548.83U/g;单独接种B6后,在2d出现一个酶活性高峰,后缓慢下降,于8d再次升高;T23与B6同时接种的处理,其变化趋势与B6单独处理相类似,但在6~8d活性稍高于单独使用B6的处理。与之相比,接种F各处理的PAL活性出现了较大的变化(图1B)。单独接种F,PAL活性始终低于对照,且在前6d一直下降,8d时稍有回升;先接种T23,再挑战接种F后,活性逐渐升高,于6d达高峰,为1914.05U/g,之后下降;先接种B6再挑战接种F的处理酶活性先升高后下降,但其峰值变化不大;只有先接种T23和B6,再挑战接种F的处理,在接种后的2d即出现一个明显高于对照的峰值,为2290.12U/g,缓慢升高后,于8d再次出现一个更加明显的大峰,其峰值为4162.87U/g,高出对照约4倍。从上述结果可以看出,T23和B6复合使用对PAL活性增强的影响要比两者的单独使用明显,尤其在挑战接种F后,两者复合使用对PAL活性上升的幅度要比单独使用高,持续时间更长。2.2.2POD活性如图2A所示,在不接种F的处理中,甜瓜根系POD活性在复合接种B6与T23后的第2d显著上升,出现酶活性高峰达1197.27U/g,之后有所下降,8d时又有所回升,其峰值为1180.14U/g;单独接种B6的处理酶活性2~6d内平稳上升,变化不大,8d突然升高,峰值达1735.97U/g,高于其它处理;单独接种T23后,POD活性变化不是十分明显,8d峰值达805.93U/g。相比之下,复合接种T23与B6,再挑战接种F,其POD活性变化十分显著,第2d就出现一个酶活高峰,稍有下降后又继续升高,到接种后8d,POD活性峰值达1931.99U/g,高出对照约10倍;接种B6后的处理在4d达活性高峰之后就开始下降,8d峰值达311.86U/g;接种T23后挑战接种F的处理在6d出现一个酶活性高峰达685.84U/g,之后有所下降(图2B)。由此可见,尽管在不接种F和接种F的各个处理中,B6和T23单独接种对POD活性上升有促进作用,但在挑战接种F之后,复合接种对POD活性上升的影响还是高于单独接种。2.2.3PPO活性不接种F的各个处理,PPO活性变化范围在439.85~679.64U/g之间(图3A)。接种F的各个处理中(图3B),单独接种F的处理于2d即出现一个明显的峰,峰值达760.85U/g,比对照高1.5倍,之后急骤下降,然后又稍为上升,但幅度不大,第8d酶活性达512.78U/g;接种T23后,挑战接种F的处理,在接种后2d酶活性下降,且低于对照,之后逐渐上升,8d达高峰,酶活性达831.14U/g;B6+F的处理其PPO活性始终低于对照,呈下降趋势;但B6和T23复合接种后再挑战接种F,PPO活性急骤上升,明显高于其他处理,8d达1040.91U/g,明显高于对照463.94U/g。说明挑战接种F比不接种F对甜瓜根系PPO活性的影响大,而且在挑战接种F的处理中,T23和B6复合接种对PPO活性上升在接种后的8d之内有持续的促进作用。2.2.4β-1,3-葡聚糖酶活性B6与T23复合接种后,β-1,3-葡聚糖酶活性急骤升高,是对照的5倍,第4d稍有下降,6~8d趋于平稳,酶活性变化较其他处理明显;B6单独接种后,酶活性较高,8d达78.33U/g;接种T23后,酶比活性变化趋势稍低于对照。挑战接种F后,β-1,3-葡聚糖酶活性变化趋势与不接种F的变化趋势相类似(图4)。由此可以看出B6和T23复合接种能明显诱导甜瓜根系β-1,3-葡聚糖酶活性的增强。3木霉与内生细菌的复合诱导抗性多年来国内外学者对木霉的生防应用、生物药剂开发以及生防机制做了许多尝试和深入的研究,并相继有商品化木霉制剂问世。其生防机理主要是木霉对病原菌有拮抗作用,可阻止病菌侵染,然而病菌一旦进入根系维管束便很难防治。此外高温、干燥、化学农药、化肥、重金属等逆境因子能干扰木霉在土壤内的活性,而且对其在作物根表的定殖有明显抑制作用。本研究应用内生枯草芽孢杆菌与绿色木霉复合处理防治甜瓜枯萎病,以弥补只能定殖于根表拮抗木霉的不足。通过温室试验的研究证明了木霉与内生细菌复合处理可提高对甜瓜枯萎病的防治效果。植物诱导抗性的机制是多方面的,其中包括了与木质素形成有关的苯丙烷类代谢途径中有关酶活性的增加、植保素的合成以及病程相关蛋白(PRs)等多种生理生化因子。其中PAL、酚类氧化或缩合的POD、PPO、β-1,3-葡聚糖酶是植物防御反应的重要酶系,成为国内外许多学者在寄主与病原互作过程中评价植物抗病性的重要生理指标,尤其PAL是酚类物质、植保素和木质素合成的关键酶,植物在受到病原菌侵染或激发子刺激后PAL活性会首先上升。焦琮等用康氏木霉处理棉花和菜豆幼苗后,过氧化物酶活性提高。Elad等利用哈茨木霉T39接种根部或叶子后,控制了灰葡萄孢引起的病害,认为诱导抗性是重要机制之一。夏正俊等从棉花内分离出