香蕉枯萎病菌内生菌的分离及拮抗活性筛选

香蕉枯萎病菌内生菌的分离及拮抗活性筛选

香蕉萎缩，也称为香蕉耿伊洛伊木马萎缩，是由阻断氨基酸（oxyspormf.c.）引起的。这是一种毁灭性的香蕉真菌病，属于外部检疫对象。该病害在许多国家地区均有发生,近几年在我国危害尤为严重。目前尚未有理想的抗病品种及有效的化学防治方法。生物防治因其既能防治病虫害,又能保护生态平衡,成为人们研究的热点。利用根际微生物及体表微生物防治该病菌已有一些报道,但这些生防菌易受周围环境条件的影响,不易在病原物存在的环境中稳定繁殖,从而严重影响其防效。作为生物防治重要微生物资源之一的内生菌,它具备受外界环境影响小,易于在宿主上定殖,产生抑菌活性物质新颖等特点,因此利用拮抗性内生菌来进行生物防治具有独特的优势。曹理想等首次报道了粉蕉内生放线菌玫瑰浅灰链霉菌株对香蕉枯萎病菌有明显的拮抗作用;殷晓敏等从生长正常的香蕉假茎内分离获得1株枯草芽孢杆菌,能明显抑制香蕉枯萎病菌菌丝生长,培养液滤液对孢子萌发具有良好抑制效果。可见分离筛选拮抗内生菌株防治该病害切实可行。但香蕉枯萎病拮抗内生菌的分离筛选研究主要集中于从香蕉植株中获得,另外关于内生菌防治香蕉枯萎病的盆栽试验报道较少。海南省自然资源丰富,热带植物种类繁多,变叶木、益智、阴香、槟榔、椰子和菠萝蜜6种常见热带植物,取材方便。这些植物在热带地区经过长期演化,形成自身独特的微生物区系,在热带地区具有广泛的适应性。为获得对香蕉枯萎病具有高拮抗活性的内生菌,本文从变叶木、益智、阴香、槟榔、椰子和菠萝蜜6种植物中分离、筛选内生拮抗菌株,并对拮抗效果理想的菌株进行盆栽防效试验,以期获得具有潜在应用价值的生防菌,为丰富香蕉枯萎病生防资源库奠定基础。1材料和方法1.1试验材料1.1.1南药实行来源益智(AlpiniaoxyphyllaMiq.)、阴香(Cinnamomumburmannii)、槟榔(Arecacatechu):采集于海南热带植物园南药圃;椰子(CocosnuciferaL)、变叶木(Codiaeumvariegatum)、菠萝(Artocarpusheterophyllus):采集于海南大学儋州校区。香蕉(MusaABB)组培苗,由海南大学环境与植物保护学院提供。1.1.2ysporumsp.c设计标准香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)4号生理小种。马铃薯葡萄糖培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基。1.2实验方法1.2.1组织消毒和内生放线菌分离将采集的新鲜健康供试植株根、茎、叶用自来水冲洗干净,室内晾干后,用75%酒精浸泡3～8min(根、茎8min,叶3min),无菌水冲洗3～4次,再用0.1%升汞浸泡2～3min,无菌水冲洗5次。无菌条件下将上述处理的各组织在培养基上作印迹,同时将表面消毒最后一次的无菌水涂抹于供试培养基上,做对照处理,检测植物表面消毒是否彻底。采用组织块法进行内生真菌分离,研磨法进行内生放线菌及细菌分离。分离平板适温培养2～7d。1.2.2内生菌的纯化在空白对照组没有任何菌株生长的情况下,对分离出的内生菌进行纯化。内生真菌采用菌丝顶端逐步纯化法进行纯化,内生放线菌、细菌采用多次划线法进行纯化,纯化得到的菌株斜面保存,备用。1.2.3抗菌活性筛选将香蕉枯萎病病原菌及分离出的内生菌扩大培养,备用。采用对峙培养法对分得的内生真菌进行拮抗活性筛选:利用5mm的打孔器打取纯化好的内生真菌菌饼,接种于PDA平板中央,两边2cm处对峙接种同样大小的靶标菌菌饼,以中间不接内生菌为对照,每个处理重复3次,在25℃的培养箱中培养3d,用十字交叉法测量菌落生长直径,按下面公式统计抑菌率:菌落直径(mm)=测量菌落直径平均值-5.0采用对峙划线法对分得的内生放线菌、细菌进行拮抗活性筛选:用直径为5mm的打孔器打取靶标菌菌饼,接种于PDA培养基中央,在距离菌饼2cm处划线接种内生细菌。以不接内生放线菌、细菌为对照,每个处理3次重复,在25℃的培养箱中培养1～3d,测量抑菌带大小。1.2.4内生菌培养和病料处理按要求配置菌株发酵液及查氏培养液,分别接入内生菌及靶标菌,适温180r/min振荡培养3～5d,备用。从海南大学儋州校区周边非香蕉种植地采集土壤,过20目筛,160℃灭菌2h,备用。取四叶期的香蕉组培苗,用清水将其根部冲洗干净,定植于已灭菌的土壤中,在28℃、20001x光照、12h光照/12h黑暗的下培养。10d后灌根法接入50mL浓度为109cfu/mL内生菌培养液,以无菌水为对照,每处理20次重复,在28℃、20001x光照、12h光照/12h黑暗的下培养。施加内生菌4d后,以伤根法接入20mL浓度为107cfu/mL靶标菌培养液,于接种第14d第1次调查各处理的病情指数和防治效果,以后每隔8d调查1次,共调查3次。香蕉枯萎病的分级标准参照何欣等进行修改:0级:健株;1级:植株下部叶片出现枯萎;2级:20%以下的叶片枯萎;3级:有20%～40%叶片枯萎;4级:有40%～60%叶片枯萎;5级:有60%～80%叶片枯萎;6级:整个植株枯萎,死亡。2.1植物内生菌的种类和组织通过常规组织表面消毒法对供试植株:变叶木、益智、阴香、槟榔、椰子和菠萝蜜的根、茎、叶进行内生菌分离,结果见表1由表1可知:从供试的6种植物中共分得内生菌91株,其中从变叶木植物组织中获得菌株最多,分得40株,从槟榔、椰子中获得菌株较少,只有8株。6种植物获得菌株数量顺序为:变叶木>益智>阴香>菠萝蜜>槟榔=椰子;从获得菌株种类来看,分得细菌最多,占分离总数的49.5%,其次为真菌、放线菌最少,仅占分离总数的8.8%;由表1还可以看出,同一种植物的不同组织中内生菌的数量不同,如变叶木40株内生菌中有22株分自根部,而叶部只有7株;益智14株内生菌株中有8株分自叶部,分自茎部的只有1株,总体来讲,所分植物根部获得菌株较多,茎部次之,叶部较少;另外不同植物相同组织内生菌数量也不同,如变叶木茎部分离获得11株内生菌株,而益智茎部只分离获得1株内生菌株。2.2内生真菌的抑菌率采用皿内对峙划线法对获得的38株真菌进行皿内拮抗活性测定,结果发现只有4株内生真菌对香蕉枯萎病病原菌具有拮抗作用,其余34株菌均没有拮抗活性,有拮抗活性菌株抑菌率见表2。由表2可知分自变叶木茎部BYJ1-2皿内拮抗效果相对较好,抑制率为30.75%,其余3株菌抑菌效果不理想,抑菌率均低于20%。2.3菌株抑菌效果将分离得到的内生放线菌、细菌与靶标菌经对峙划线培养3～4d后,发现放线菌对香蕉枯萎病病原菌没有明显的拮抗效果;有10株分自变叶木及阴香的内生细菌对供试靶标菌有拮抗效果,4株抑菌效果较为明显,相应结果见表3。由表3可以看出,分自阴香根部的YXG2-3的抑菌效果最明显,抑菌带约在20mm左右(见图1),其次BYG2-5、BYJ5-1、YXJ2-2也有很好的抑菌效果,抑菌带均在15mm以上,其余6株内生细菌抑菌带不明显,均小于5mm。2.4yxg2-3菌株的培养效果按照香蕉枯萎病发病规律,分别在接种香蕉枯萎病的第14d、22d、30d进行香蕉枯萎病的病情指数和防治效果调查,结果如表4由表4可知:对供试香蕉苗接种病原菌后,从14d开始发病,至30d达发病盛期。供试菌株均有一定的防治效果,其中YXG2-3效果最理想,防效为63.8%,达极显著水平;其余3株供试内生菌防效均低于30%,其中菌株BYJ5-1防效最不理想,防效仅为9.3%。另外由表4还可以看出,YXJ2-2接种14d时同YXG2-3效果相同,植株均没有发病,但随着接种时间延长,菌株防治效果明显下降,说明该菌株防治效果不稳定,可能与该菌株在土壤中适应能力有关。3内生细菌抑菌和抗菌剂的筛选结果本实验利用常规组织表面消毒法对变叶木、益智、阴香、槟榔、椰子及菠萝蜜6种植物的根、茎、叶进行了内生菌分离,并对分离获得的菌株进行了皿内拮抗活性测定,结果发现:不同植物种类获得内生菌的数量有很大的差异,同一种植物不同部位菌株种类及数量分布也各不相同,其原因一方面可能是因为不同植物物种间以及同一植物不同部位内生菌分布本身存在差异,另一方面与实验操作过程中组织消毒的时间也存在必然的联系,如有的植物组织因为表皮较薄,消毒时间过长,可能会导致分离得到的菌株数量减少。另外有些内生菌不能在人工培养基上生长,有些内生菌则因为生长缓慢而被生长相对较快的菌株所掩盖,也是其中重要原因。皿内拮抗作用筛选结果发现,分得内生真菌抑菌效果均不够理想,内生细菌抑菌效果较好,尤其菌株YXG2-3抑菌带达20mm左右。在盆栽实验中该菌株防效为63.8%,与其他处理相比达极显著水平。分析获得菌株多数抑菌效果不理想原因可能是因