木薯细菌性枯萎病菌胞外酶活性与病斑面积的相关性分析

木薯细菌性枯萎病菌胞外酶活性与病斑面积的相关性分析

作为世界上三大甘薯种类之一，它被称为“地下粮仓”、“淀粉之王”和“特殊收获”。这是热带地区的重要粮食。木薯不仅是重要淀粉作物,而且是我国重要的能源作物之一,是一种很有发展潜力的再生能源作物,在食品、饲料及轻工业上得到开发利用,成为与国计民生、人们生活息息相关的重要资源。近年来木薯细菌性枯萎病为害日趋严重,严重困扰我国木薯的生产。但我国在木薯细菌性枯萎病菌(Xanthomonasaxonopodispv.manihotisVauterin,Kerters&Swings,简称Xam)胞外酶活性与致病力关系等基础学的研究尚属空白。植物病原菌产生的胞外酶(如纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和淀粉酶等)是其致病性重要的生化因子,这些胞外酶在病原菌获得营养、降解寄主细胞壁和诱导细胞坏死等方面起重要作用。探明哪些胞外酶在致病过程中发挥作用,以及阐明胞外酶与病原菌致病力强弱的关系等,在植物和病原菌互作关系的研究中越来越得到重视。鉴于我国目前在木薯细菌性枯萎病致病机制等基础学方面的研究滞后于科研和生产形式,本文开展木薯细菌性枯萎病病菌致病力差异与胞外酶活性的研究,以期寻找与致病性有关的生化因子,为抗病育种工作提供理论依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1病害分离和测定供试Xam菌株分别为BH-I、BYI-3、RAI-3、BYⅡ-3、EYI-7、Im8639I-3、RAⅡ-3、BYⅢ-5、BYI-9、BHⅢ-7、EYI-3、Im8639I-8,均从病害样本(广西植保总站植物检疫站提供)分离获得,经柯氏法则测定致病性后在-20℃下保存。1.1.2试验中的甘薯供试木薯品种为GR911(广西农业科学院经作物研究所杨守臻副研究员惠赠)。1.2方法1.2.1海绵吸足细菌悬浮液制备和接种Xam菌株致病力测定参照岑贞陆等的方法,稍做改进:将供试Xam菌株在牛肉膏蛋白胨培养基(蛋白胨5g、牛肉膏3g、酵母膏1g、蔗糖10g、琼脂17g、蒸馏水1000mL,pH7.2)上培养48h,再用无菌水配制成108cfu/mL细菌悬浮液备用。在木薯块根形成期用直径为9cm的无菌海绵吸足细菌悬浮液后置于培养皿内,将木薯顶叶往下数第1张转绿单叶的中部裂片叶平放在海绵上,用针距为1.0cm×1.0cm的4根大头针固定在橡皮上灭菌后,将其蘸1次细菌悬浮液后刺伤1张裂片叶,再将橡皮挤压一下海绵至挤出菌液再拔出,每个菌株针刺5张,接种过程注意给海绵补充细菌悬浮液。接种后第10d将发病的叶片病斑剪下,用光电叶面积仪测量病斑的面积,病斑平均面积按以下公式计算。病斑平均面积=∑各裂片叶病斑面积5×1.1=∑各裂片叶病斑面积5×1.11.2.2蛋白酶活性测定Xam菌株蛋白酶活性的检测及评价参照臧宁的方法,稍做改进:Misaki培养基[谷氨酸钠1g,NaCl0.1g,K2HPO4·3H2O0.5g,MgSO4·7H2O0.3g,Na2HPO4·H2O0.7g,(NH2)2SO42g,酵母粉3g,蔗糖20g,琼脂15g,蒸馏水1000mL,pH7.0]中加入无菌脱脂牛乳(终浓度为2%),混匀后往含有薄层纯琼脂培养基的平皿上制备厚度一致的平板,用微量进样器吸取2μl供试Xam悬浮液点样于平板上,置于28℃培养,能产蛋白酶的菌株其菌落周围可形成清晰的蛋白酶水解圈,培养72h后测量菌落直径和水解圈的直径,各菌株蛋白酶活性评价按以下公式计算结果表示(以下各胞外酶活性的评价相同):Up=D-d。式中:up表示酶活评价,D水解圈的直径,d表示菌落直径。1.2.3生长活性的测定Xam菌株酯酶活性的检测及评价参照Hakin的方法:在酯酶检测培养基(蛋白胨10g,NaCl5g,酵母膏3g,CaCl2·2H2O0.1g,琼脂17g,蒸馏水1000mL,pH7.4)中加入Tween20(终浓度为0.1%),混匀后往含有薄层纯琼脂培养基的平皿上制备厚度一致的平板,用微量进样器吸取2μl供试Xam悬浮液点样于平板上置于28℃培养5～6d后,能产酯酶的菌株其菌落周围有晶状物析出,可视为酯酶水解圈,测量菌落直径和水解圈的直径,评价各菌株的酯酶活性。1.2.4微生物活性Xam菌株果胶酶活性的检测及评价参照Hakin的方法:在Misaki培养基中加入聚果胶酸钠(终浓度为1%),每1000mL培养基再加入6mL10%CaCl2·2H2O,混匀后往含有薄层纯琼脂培养基的平皿上制备厚度一致的平板,用微量进样器吸取2μl供试病原菌悬浮液点样于平板上置于28℃培养72h后,先测量菌落直径,然后往平板上倒入20mL1%十六烷基三甲基溴化铵,水解圈出现后倒去液体,测量水解圈的直径,评价各菌株的果胶酶酯酶活性。1.2.5平板染色工艺Xam菌株纤维素酶活性的检测及评价参照臧宁的方法,稍做改进:在牛肉膏蛋白胨培养基中加入羧甲基纤维素钠(终浓度为0.5%),混匀后往含有薄层纯琼脂培养基的平皿上制备厚度一致的平板,用微量进样器吸取2μl供试病原菌悬浮液点样于平板上置于28℃培养72h后,先测量菌落直径,然后往平板上倒入20mL0.1%的刚果红染色30min,水洗两次,再用20mL1M的NaCl脱色两次,每次20min。能产生胞外纤维素酶的菌株,在红色背景下,其菌落生长处及周围形成一透明圈,评价各菌株的纤维素酶活性。1.2.6菌株的淀粉酶活性测定Xam菌株淀粉酶活性的检测及评价参照臧宁的方法,稍做改进:在NA培养基中加入可溶性淀粉(终浓度为0.2%),混匀后往含有薄层纯琼脂培养基的平皿上制备厚度一致的平板,用微量进样器吸取2μl供试病原菌悬浮液点样于平板上置于28℃培养48h后,先测量菌落直径,然后往平板上倒入Logl’s碘液(I1g+KI3g+水300mL)20mL,能产淀粉酶的菌株其菌落周围出现水解圈,倒去液体,测量水解圈的直径,评价各菌株的淀粉酶活性。1.2.7致病性力测定分别将致病力为强、中、弱的Xam菌株对应的病斑平均面积相加后再平均,再分别将致病力为强、中、弱的Xam菌株对应的up值相加后再平均。以病斑面积再平均数据作为y值,up值再平均数据作为x值,采用数据统计工具(MicrosoftExcel2003)进行回归分析。2结果与分析2.1致病性力比较供试Xam菌株致病力测定结果见表1,致病力表现为强的菌株共5株,分别为BH-I、RAI-3、BYⅢ-5、BHⅢ-7、EYI-3,其中BH-I、BYⅢ-5这两个菌株的致病力最强,接种后病斑平均面积均超过了60mm2;致病力表现为中的菌株共4株,分别为BYI-3、BYⅡ-3、EYI-7、RAⅡ-3;致病力表现为弱的菌株共3株,分别为Im8639I-3、BYI-9、Im8639I-8,其中Im8639I-3菌株的致病力最弱,接种后病斑平均面积不到10mm2。2.2种胞外酶的活性在酶基质的平板上,供试12株Xam菌株均能检测到纤维素酶、淀粉酶、酯酶等共3种胞外酶的活性(图1～3),未检测到蛋白酶、果胶酶这2种胞外酶的活性。供试Xam12株菌株的胞外纤维素酶、胞外淀粉酶和胞外酯酶这3种胞外酶活性的up值分别为5.74～10.98、3.73～9.18和13.31～16.04(表2)。2.3胞外纤维素酶活性与病斑面积相关性回归分析结果见表3,Xam胞外淀粉酶up值与病斑平均面积呈正相关,回归方程为y=0.0426x+4.9522,r值为0.9789(r0.01=0.9587),表明胞外淀粉酶活性与病斑面积密切相关,Xam胞外纤维素酶、胞外酯酶的回归方程分别为y=0.0016x+8.7841、y=0.0064x+14.373,r值分别为0.0735、0.2410(r0.01=0.9587),显示胞外纤维素酶、胞外酯酶活性与病斑平均面积相关性不明显。3胞外酶活性的变化木薯细菌性枯萎病在世界大多数木薯产区都有发生,其症状表现随生态地区而异,因此有研究者认为病原菌存在有不同的致病类型或生理小种,也有学者认为木薯-病原菌不存在相互作用或相互作用有限。本研究中,供试12株Xam菌株的致病力强弱差异明显。研究结果差异的原因可能是接种所用的木薯品种、方法不同而异。如果Xam存在不同的致病类型或生理小种,将使木薯的抗病育种,特别在抗病稳定性方面遇到难题,因此,有必要统一鉴别品种、接种方法和分级标准,以澄清病原菌是否存在致病型分化或生理小种。本研究首次在含有酶基质的培养基上测定了Xam菌株5种胞外酶的活性,供试12株Xam菌株在含有酶基质平板都分别对应检测到淀粉酶、纤维素酶和酯酶,未能检测到蛋白酶和果胶酶的活性,是由于Xam菌株不能产生蛋白酶和果胶酶,还是检测方法灵敏度不够高,尚需进一步研究。根据菌株胞外酶的活性结合其接种后的病斑平均面积进行回归分析,Xam菌株胞外酯酶和胞外纤维素酶活性与病斑面积相关性不明显,而胞外淀粉酶与病斑面积密切相关(见表3),推测胞外淀粉酶在病原菌的致病过程中起着比较重要的作用。这在国内属首次报道。周叶方等认为水稻细菌性条斑病菌[Xanthomonascampestrispv.oryzicola(Fangetal.)Dye,简称Xco]在致病过程中果胶酸酯裂解酶起着比较重要的作用,而聚半乳糖醛酸