药物筛选基础知识

抗肿瘤药物体外筛选基础知识2010.4.6前言目前，化学治疗仍然是治疗恶性肿瘤的重要手段之一。但用于临床的抗肿瘤药物普遍存在选择性差、毒副作用大、易产生耐药性等问题，寻找选择性高、毒副作用小的抗癌药仍然是抗肿瘤新药研发重点。每年都有大量的天然提取物以及合成化合物出现,因此进行药物初筛是非常重要的一个环节。常见的抗肿瘤药物体外筛选方法主要有：MTT比色法、SRB法、CCK-8法、酸性磷酸酶法、ATP生物发光法等。由于MTT比色法具有简便、快速、灵敏、重复性高、无放射污染、有较好的临床符合性等优点，成为目前最常用的体外肿瘤药敏试验方法。该方法的原理：四甲基偶氮唑盐，即MTT，为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料。可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下四氮唑环开裂，生成蓝紫色的甲臜(formazan)结晶。由于死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原，因此甲瓒结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。还原生成的甲瓒结晶可被二甲基亚砜（DMSO）溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，即可反映出活细胞数目。样品的保存根据所需浓度，称取一定量的药物，配置药物母液，于-20℃储存。剩余药品存放在630的公用冰箱中，交由相关老师保存，并记录药品名称和剩余数量。

细胞系的选择初筛时一般选取3～5种敏感人癌细胞株，如肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、胃癌和宫颈癌。活性明显的化合物可进一步扩大瘤谱进行研究。如果化合物仅对一种特定的肿瘤如肺癌有效，则可采用更多种类的肺癌细胞系作进一步研究。样品的配置和浓度选择脂溶性药品使用DMSO配置，水溶性药物使用纯净水配置。使用DMSO溶解药品时，为了消除DMSO的细胞毒性，其终浓度应低于1‰。根据相关参考文献选取4～5个给药浓度，并且浓度跨度尽量覆盖化合物可能的IC50值。若无参考文献，则一般最高给药浓度设在100ug/ml或100uM/L，各个浓度间隔可以设大一些（10倍）。阳性药的选择阳性对照药物原则上应选择与待筛化合物具有相同结构、相同药理作用或相同作用机制，已在国内上市的同一类药物。

细胞培养复苏细胞进行药物筛选实验之前先复苏所需细胞株。细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮或-80℃冰箱中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。细胞冻存冻存前3代以内的细胞，并且冻存数目要大于或等于复苏数目，以保证有充足数量的冻存细胞。冻存方法：将冻存管放入程序降温盒中，旋紧盒盖，放入-80℃冰箱。至少放置4个小时，才能放入液氮中保存。程序降温盒使用5次更换一次异丙醇。

细胞传代细胞培养液由90%培养基和10%血清组成。不同细胞株所用的培养基和血清类型不尽相同。例如，人白血病细胞株HL-60的培养液由RMPI1640培养基加胎牛血清配置而成；人非小细胞肺癌细胞株A549的培养液由RMPI1640培养基加小牛血清配置而成；人乳腺癌细胞株MCF-7培养液由DMEM低糖培养基加胎牛血清配置而成；人脑胶质瘤细胞株U87的培养液由DMEM高糖培养基加胎牛血清配置而成等。