木丹颗粒对糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡及nf-、caspase-3表达的影响

木丹颗粒对糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡及nf-、caspase-3表达的影响

糖尿病是由胰岛素分泌不足和胰岛素作用障碍引起的代谢性疾病，具有慢性高血压特点。糖尿病病因和发病机制复杂,存在异质性,至今尚未完全明了。但越来越多的研究表明,胰岛β细胞凋亡不仅是1型糖尿病致病的直接原因,而且也是2型糖尿病发病的重要因素。以往实验研究证实,新药木丹颗粒具有调节影响神经代谢障碍物水平,修复受损神经传导速度,改善血液微循环,达到治疗糖尿病周围神经病变的作用。但对胰岛β细胞凋亡作用影响报道甚少,本研究初步探讨木丹颗粒对胰岛β细胞凋亡作用及机制,为临床研究提供理论依据。1.1试剂和仪器清洁级SD大鼠80只,雄性,体重(200~220)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:scxx(京)2006-0009。链尿佐菌素(STZ):美国Sigma公司生产,进口分装,北京拜而迪生物技术公司供应;木丹颗粒,由辽宁奥达制药有限公司提供,规格7g/包;免疫组化试剂TNF-α、Caspase-3,细胞凋亡试剂盒,购自武汉博士德生物公司。血糖试纸及稳步强生血糖仪购自美国强生公司。TD10001电子天平,TD1002B电子天平,购自浙江余姚金诺天平仪器有限公司。显微镜,购自奥林巴斯(BX51)。1.3造模过程及统计学处理1.3.1动物模型的制备及分组80只大鼠实验室适应性喂养1周后,取8只为正常空白对照组,余下的大鼠禁食12h后,将STZ用0.1%mmol/L枸橼酸缓冲液(pH=4.2,4℃)配成1%浓度,按53mg/kg体重剂量腹腔注射,72h后尾静脉取血,用血糖仪测定血糖,凡血糖≥16.7mmol/L纳入实验。成模的大鼠按血糖值随机分为6组:模型组,木丹颗粒高、中、低剂量组,甘精胰岛素组,每组10~11只。1.3.2给药方法正常组及模型组:生理盐水10mL/kg灌胃,每日1次。木丹颗粒分别予高剂量4.6g/(kg·d)、中剂量2.3g/(kg·d)、低剂量1.15g/(kg·d),日1次灌胃,连续灌胃4周;甘精胰岛素组按予1U/100g左下腹腹腔注射,每日1次,连续4周。于给药后2周取部分大鼠的胰腺做病理,给药4周后,禁食10小时,全部处死,取材,进行各项指标的检测。1.3.3检测指标试验过程中,分别于造模后2周、4周取大鼠尾静脉血,测空腹血糖,并取胰腺胰尾部分,按免疫试剂盒操说明操作,观察胰岛细胞TNF-α、Caspase-3的蛋白表达情况。TUNEL法检测胰岛细胞凋亡,按原位细胞凋亡试剂盒说明操作,DAB显色凋亡阳性细胞,观察凋亡细胞的形态。1.3.4统计学处理数据按均以±s表示,用SPSS11.5统计软件进行因素方差分析;组间比较采用方差分析,P<0.01为差异有统计学意义。2结果2.1不同剂量木丹颗粒治疗前后血糖值的比较见表1。由表1可知:与正常组相比,模型组血糖值明显升高,有显著性差异(P<0.01),木丹颗粒高、中、低剂量组治疗后血糖值变化不明显,无显著性差异(P>0.05);甘精胰岛素治疗后血糖值显著降低,具有显著性差异(P<0.01),说明木丹颗粒无显著降血糖作用。2.2免疫检查结果免疫结果的判定:免疫染色后,棕黄色颗粒多,成深棕色者为强阳性;棕黄色颗粒少,呈浅棕色者为弱阳性。2.2.1凋亡细胞浓度正常组细胞核圆形或椭圆形,胞体透亮,未见核固缩细胞;DM组凋亡细胞数量多,高倍镜下可见核固缩、深棕褐色,呈强阳性(图A1);木颗粒中高剂量治疗组可见核固缩、棕染的细胞减少,呈弱阳性(图A2)。2.2.2各组细胞培养及tnf-深铅颗粒表达情况正常组大鼠胰腺TNF-α的表达呈弱阳性表达,胰岛细胞棕黄色染色颗粒少,几乎不表达,腺腔较胰岛表达多,且腺腔结构规整,边缘规整,细胞排列整齐(图B1);DM组,TNF-α深棕色颗粒多,表达呈强阳性,腺腔结构散乱,细胞不规整(图B2);木颗粒中,高剂量组较DM组有改善,颗粒腺腔结构较规则,表达呈弱阳性,但仍可见少量的深棕色颗粒(图B3)。木丹颗粒低剂量组与DM组相近,呈强阳性。3不同途径诱导胰岛细胞凋亡胰岛β细胞能合成、分泌、储存和释放胰岛素,胰岛素对调节代谢和保持机体血糖稳态有重要意义。因此,胰岛β的受损,可造成胰岛素分泌障碍,导致1型或2型糖尿病,β细胞亡是其死亡的主要形式,在糖尿发病机制中伴有重要角色。TNF-α来源于体内多种细胞,如免疫细胞,内皮细胞,具有较广泛的生物活性,1、2型糖尿病时TNF-α均不同程度增加。TNF-α可通过与靶细胞膜上的受体(TNFR1、TNFR2)结合传递信号,触发级联而导致细胞凋亡,由于TNFR1、TNFR2相关的死亡结构域蛋白(TRADD)、FADD等均表达于胰岛β细胞,因此TNF-α可以时间和剂量的依赖方式诱导胰岛β细胞凋亡。半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspases)家族是细胞凋亡过程的中心成分。根据其在级联反应中的上下游位置和功能不同分为起始caspases和效应caspases。caspase-3属于后者,可被上游的起始caspases激活,继而作用于特异性底物使细胞发生生化及形态学改变,导致细胞凋亡,是细胞凋亡的关键环节。因此,Caspase-3是反映凋亡的一个很好指标。TNF-α可通过与FADD结合,激活无活性的caspase-8进而激活下游caspase-3,从而触发一系列的级联反应,诱导β细胞凋亡。本实验结果表明,木丹颗粒中高剂量组可明显降低TNF-α及Caspases-3的表达,抑制胰岛细胞凋亡。虽在降糖方面疗效不及甘精胰岛素,但却可通过减少胰岛β细胞凋亡,起到延缓或防止糖尿病的作用。然而中药有其作用多元化的特点,且细胞凋亡途径复杂,存在多交叉相互作用的特点,因此进一步深化研究木丹颗粒抑制胰岛细胞凋亡的作用机制,可为更好的指导糖尿病临床用药提供理论依据。1材料和方法1.2试剂和药物2.2.3ase-3表达正常组大鼠Caspase-3的表达成弱阳性表达,呈浅棕色(图C1);DM组大鼠Ca