毛果鱼藤藤茎hplc指纹图谱研究

毛果鱼藤藤茎hplc指纹图谱研究

毛果鱼藤是豆科植物毛果鱼藤的干燥枝条，也被称为土壤甘草。主要分布在广东、广东等地区。具有润水除湿、止痒、止咳等功效。作为广西壮族民间验方的组成之一,毛果鱼藤常被用于治疗膀胱炎、肾炎、尿道炎、咳嗽等症状。中药及其制剂均为多组分复杂体,且受气候、生态环境等方面的影响,各化学成分稳定性存在一定的差异,造成不同批次药材的质量优劣不同,而中药指纹图谱能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量,进而对药品质量进行整体描述和评价。目前国内外对毛果鱼藤的质量标准、化学成分、生物活性等方面的研究比较少,曾有研究者采用薄层色谱和紫外光谱对毛果鱼藤进行鉴别研究,笔者实验室对毛果鱼藤的化学成分进行了初步的研究,发现其含有大量有活性的化合物,对其化学成分的活性追踪试验显示,不同极性部位具有一定的抑制癌细胞生长的作用。本文应用HPLC方法对不同产地的毛果鱼藤藤茎进行指纹图谱研究,并针对不同极性部位进行抗癌活性实验,以期为进一步深入了解毛果鱼藤的化学成分、生物活性及制定毛果鱼藤的质量控制标准提供科学依据,为壮药毛果鱼藤的进一步开发、利用提供实验依据。1测定毛果鱼藤茎robustici结果SHIMADZULC-15C高效液相色谱仪;XH-100A微波催化合成/萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司);SHIMADZUUvmini-1240紫外可见分光光度仪;3111细胞培养箱(ThermoFisherScientific)。甲醇、乙腈均为色谱纯(Fisher公司),水为超纯水,其余试剂均为分析纯。10批毛果鱼藤藤茎分别于2012~2013年购于广西靖西(1~6批)、德宝(7~10批),由广西中医药大学田慧教授鉴定为豆科鱼藤属植物毛果鱼藤(DerriseriocarpaHow)的干燥藤茎。对照品Robusticacid为本实验制备,已经核磁共振仪检测为Robusticacid(纯度:96.3%)。癌细胞株:NCI-H460人肺癌细、SW480人结肠癌细胞、SGC7901人胃癌细胞、Hela人宫颈癌细胞均由广西医科大学附属肿瘤医院基础免疫室提供。2方法和结果2.1检测条件及检测波长色谱柱:WondaSilTM-C18(5μm,4.6mm×250mm);流动相:乙腈(A)-0.5%醋酸溶液(B),梯度洗脱(0~20min,40%A→60%A;20~30min,60%A;30~45min,60%A→80%A;45~60min,80%A);流速:1.0mL·min-1;检测波长:296nm;柱温:30℃;进样量:10μL。2.2毛果鱼藤茎提取将毛果鱼藤藤茎粉碎成粗粉(24目),称取粗粉5g,加入95%乙醇50mL,采用微波萃取仪进行回流提取,提供功率400W,提取温度70℃,提取2次,每次20min,合并提取液,离心15min,转速3000r·min-1,取上清液,95%乙醇定容至100mL,作为HPLC指纹图谱检测的供试品溶液。另称取毛果鱼藤藤茎粗粉50g,加入95%乙醇,提取方法同上,提取液浓缩,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取;分别合并、浓缩萃取液。取上述萃取液浸膏各2mg,分别用吐温80助溶(终浓度小于千分之一),分别加1640细胞培养液稀释,使配成不同浓度的[石油醚部位(3.35、1.675、0.837、0.419、0.209mg·mL-1)、氯仿部位(6.7、3.35、1.675、0.837、0.419mg·mL-1)、乙酸乙酯部位(2、1、0.5、0.25、0.125mg·mL-1)、正丁醇部位(6.7、3.35、1.675、0.837、0.419mg·mL-1)]的各供试品溶液。2.3对照溶液的制备精密称取Robusticacid对照品10.0mg,置10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。2.4方法研究2.4.1仪器精密度试验取1号药材粗粉5g(24目),按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件连续进样5次,记录色谱图,考察仪器的精密度。结果表明,色谱峰的相似度在0.996~0.999之间,各色谱峰相对保留时间的RSD在0.007%~0.027%之间,各色谱峰相对峰面积的RSD在0.574%~4.351%之间,表明仪器的精密度较好。2.4.2进样测定取1号药材粗粉5份(24目),每份5g,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件进样,记录色谱图,考察方法的重复性。结果表明,各色谱峰相似度在0.999~1.000之间,相对保留时间的RSD在0.009%~0.214%之间,各色谱峰相对峰面积的RSD在0.543%~3.973%之间,表明实验的重复性良好。2.5毛果玉藤系藤蔓的指纹谱2.5.1毛果鱼藤茎hplc测定以经形态学鉴定的10批毛果鱼藤藤茎为研究对象,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件进行HPLC指纹图谱研究,记录并比较10批毛果鱼藤藤茎的HPLC色谱图,确定了16个共有特征峰,并通过HPLC分析以及供试品溶液和对照品溶液HPLC保留时间的比对,确定S峰为Robusticacid。根据结果,采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》计算机软件进行数据分析处理,建立毛果鱼藤藤茎的指纹图谱,通过软件计算,共有峰占总峰面积的80.76%,毛果鱼藤藤茎的HPLC指纹图谱见图1、图2。2.5.2参照峰和参照峰选择Robusticacid为毛果鱼藤中的已知成分,含量比较大,峰面积明显,而且保留时间适中,故选用Robusticacid(S号峰)作为参照峰。2.5.3指纹谱的共同峰的确定运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》计算机软件进行指纹图谱数据分析,10批次图谱都匹配的色谱峰标定为共有指纹图谱峰。2.5.4自动匹配的方法利用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”,以1号样品的指纹图谱作为参照图谱,采用多点校正后进行自动匹配。10批药材的相似度分析结果如表1所示,10批毛果鱼藤藤茎与对照指纹图谱的相似度值均大于0.9,显示了其与对照指纹图谱有良好的相似性,10批不同产地毛果鱼藤藤茎与对照图谱叠加图谱如图2所示,叠加效果较好。2.6比较不同极性部位的指纹图，研究肿瘤生长抑制的影响2.6.1各部位hplc检测取1号毛果鱼藤藤茎样品粗粉50g(24目),按“2.2”项下方法进行提取,提取液浓缩至浸膏,将浸膏依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取,浓缩萃取液,得4个部位的浸膏,称取上述4个部位的浸膏各40mg,分别用5mL甲醇溶解,溶液过滤,备用。按照“2.1”项下方法进行HPLC检测。各部位HPLC图谱如图3所示。由于溶剂极性的不同,各部位的HPLC图谱有明显的差异,化合物的种类及含量均有区别,且大部分成分集中在石油醚、氯仿部位;乙酸乙酯部位则显示了2个极性相对比较大的峰,而正丁醇部位在此液相条件下基本没有明显的色谱峰出现。2.6.2药物抑制浓度mtt测试取对数生长期的NCI-H460人肺癌细胞、SW480人结肠癌细胞、SGC7901人胃癌细胞、Hela人宫颈癌细胞,分别接种在96孔板中,于37℃,5%CO2恒温培养箱中培养12h,分别加入不同浓度的毛果鱼藤的石油醚部位(3.35、1.675、0.837、0.419、0.209mg·mL-1)、氯仿部位(6.7、3.35、1.675、0.837、0.419mg·mL-1)的供试品溶液、乙酸乙酯部位(2、1、0.5、0.25、0.125mg·mL-1)、正丁醇部位(6.7、3.35、1.675、0.837、0.419mg·mL-1),孵育44h后,每孔加MTT溶液(5mg·mL-1)20μL,继续培养4h,弃去上清,每孔加入DMSO150μL,振摇5min,于630nm波长校准,570nm波长处测定吸光度(A,n=3),根据吸光度计算药物对各种细胞的生长抑制率,计算公式如下:利用孙氏综合法(改进寇氏法)计算半数抑制浓度(IC50)。各部位对不同癌细胞的生长抑制结果如图4所示,毛果鱼藤的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位对NCI-H460人肺癌细胞、SW480人结肠癌细胞、SGC7901人胃癌细胞、Hela人宫颈癌细胞均具有一定的细胞生长抑制作用,并随着药物浓度的提高,抑制率越高,呈现明显的量效关系,且石油醚、氯仿部位表现出较强的抗癌活性;各部位对Hela人宫颈癌细胞的生长均显示较好的抑制作用,药物作用48h后IC50值如表4所示,氯仿部位对Hela人宫颈癌细胞的IC50值最小,为0.09mg·mL-1;石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取部位对SGC7901人胃癌细胞、Hela人宫颈癌细胞的抑制作用较好,IC50值均小于1.00mg·mL-1。结合图3、4及表2的结果可知,毛果鱼藤中的抗癌活性物质大部分集中于石油醚和氯仿部位,且活性物质极性均较小;而乙酸乙酯和正丁醇部位在此液相条件下检测出的化合物种类比较少,且含量也比较低,对癌细胞的生长抑制作用亦不如石油醚和氯仿部位明显。综上表明,毛果鱼藤藤茎中具有细胞增殖抑制作用的活性成分多集中在石油醚和氯仿部位,且抑癌活性比较强。3讨论3.1nm处吸收按“2.2”项下方法制备供试品溶液,运用紫外全波长扫描,证明样品在250~350nm处吸收较强。HPLC中选用双波长扫描,分别用254、296nm2个波长进行扫描,发现样品在296nm处基线平稳,色谱峰较多,而且分离度较好,本着指纹图谱的确认必须遵循信息量最大化的原则,选用296nm作为检测波长。3.2流动相的选择在色谱分离过程中考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.5%醋酸水溶液、乙腈-0.5%醋酸水溶液等系统作为流动相,结果显示乙腈-0.5%醋酸水溶液作为流动相,分离效果较好,峰形对称,基线稳定,而其他3个流动相系统分离效果不理想,有几个关键峰不能很好地分开,最终选择流动相为乙腈(A)-0.5%醋酸溶液(B),梯度洗脱(0~20min,40%A→60%A;20~30min,60%A;30~45min,60%A→80%A;45~60min,80%A)。4指纹图谱检测产物的含量和含量本实验建立了壮药毛果鱼藤药材的高效液相色谱指纹图谱,为毛果鱼藤药材的质量控制提供参考;通过对10批毛果鱼藤药材进行高效液相色谱指纹图谱检测可以看出:不同产地毛果鱼藤药材各色谱峰的相对保留时间基本一致,所含成分基本相同,符合指纹图谱的要求;天然产物因产地、生长环境和生长年限不同,各成分含量有一定的差异,在本图谱中也可看出各色谱峰相对峰面积有较大差异,说明有效成分的含量有较大差别;在此基础上,如果进一步开展谱效学研究,可使中药质量与其药效真正结合起来,有助于阐明中药作用机理。目前,毛果鱼藤尚处在民间壮医用药阶段,对壮药毛果鱼藤的生物活性的研究比较少,而对毛果鱼藤抗癌作用的研究目前国内外尚未见报道。本文对毛果鱼藤的抗癌活性进行了研究,结果表明,毛果