IVM小鼠脑组织神经活动配体受体相互作用通路基因表达改变可导致父源性子二代基因表达异常生殖内分泌专业

IVM小鼠脑组织神经活动配体-受体相互作用通路基因表达改变可导致父源性子二代基因表达异常-生殖内分泌专业毕业论文浙江大学硕士学位论文让我永远在追求真知的旅途中不会感觉孤单和疲倦。

致谢在这个世界上，我最需要报答和感谢的人，就是我的父母。感谢你们，把我带到了这个美好的世界，给了我自由的空气和灿烂的阳光，感谢你们，谆谆的教导，殷殷的嘱托，一直支持我的前进，一直给予我无尽的鼓舞，让我有了今天的成长。感谢所有关心、支持、帮助过我的良师益友。衷心感谢对我硕士论文进行评 审的各位专家教授，感谢对论文的指导和提出的宝贵意见!万方数据浙江大学硕士学位论文 序言专自1978年世界首例“试管婴儿”诞生以来，以体外受精．胚胎移植(invitrofertilization andembryotransfer，IVF．ET)技术及卵胞浆内精子注(intracytoplasmicsperminjection，ICSI)技术为代表的辅助生殖技术(assistedreproductivetechnology，ART)获得了巨大的进展，已成为当前不孕不育症治疗的最有效方法至今全球已经有500多万婴儿通过ART出生常规IVFT及ICSI均涉及超促排卵的过程，即通过促排药物诱发排卵，获取多个MII(metaphase II)期卵母细胞。这个过程存在诱发卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstiulationsyndrome，OHSS)的风险，据统计常规超促排卵周期的OHSS发生率为0．6．14％，其中多囊卵巢(polysticovary，PCO)及多囊卵巢综合征(polysticovariansyndrome，PCOS)病人的发生风险为最高。卵细胞体外成熟(invitromaturation，IVM)技术模拟体内卵母细胞成熟环境，从未经药物刺激或低剂量药物刺激的卵巢直接获取未成熟生殖(germinalvesiclGV卵母细胞，体外培养成熟MII期后用于ICS，是克服常规IVF．ET药物促排引起患者OHSS发生风险的理想途径，已经成为PCO和PCOS、卵巢反应不良妇女不孕症治疗的主要方法之一。IVM过程卵母细胞脱离体内自然环境，不仅内分泌和旁分泌环境改变，还要 经受相关体外操作的刺激。因为这些体外暴露和体外操作刚好处于配子成熟和胚胎早期发育的敏感窗I：1期，故易造成卵母细胞和植入前胚胎表观遗传重新编程进程的改变。目前已有研究表明IVM较常规IVF受精率、卵裂率、胚胎生长速率和移植后的妊娠率均有降低，而限于IVM开展年限，IVM子代远期安全性的研究为数不多。迄今已有研究表明IVM可能会引起子代部分生长因子表达异常及印记改变，亦有研究提示IVM子代有智能或心理运动发育指数降低、学习和语言障碍，故IVM儿基因中表观遗传学修饰异常及远期安全性受到研究者的关注。表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的学科，主要是通过基因的可遗传修饰传递遗传性状。在胚胎发育早期，III万方数据浙江大学硕士学位论文 序言不良暴露使机体发生适应性变化，导致表观遗传修饰改变，影响相关基因的表达，而且这种适应性变化可以持续到成年期，并可能引起成年期组织、器官的生理功能，甚至结构的改变。这类胚胎iNJk发育编程(developmentprogramming)异常所异常的表型及特征有可能持续至成年，甚至传递给子代，称之为传代效应(transgenerationaleffecto上述这些有可能诱发疾病的异常表观修饰称为表观突变(epimutation)，其代间传递可能是传代效应的潜在机制。现今七八十年代出生的ART儿逐步进入婚育期，ART对人类的跨代影响已逐在ART子一stfilialgenerationF1)中出现的异常表型或是一些疾病的高危因素是否会在子二代(secondfilialgeneration，F2)代中传而ART儿婚育后代要先前本课题组应用芯片技术对IVM小鼠F1代的脑组织进行了全基因组芯片分析，其中芯片分析中的差异性结果Go(geneontology)分析提示脑认知精神水平的指向进一步的信号通路(pathway)分析发现IVMF1代新生小鼠中神经活动配体受体相互作(neuroactiveliganreceptorinteraction通路中的八个基因(Gabra6,Glral，Gria4,Grid2,Agtr2,Slpr5,Galrl，Grm4)存在不同程度的上调，但到成年后(10w龄)这些IVM小鼠的上述基因表达异常多数已被纠正，仅10wIVM雌性小鼠仍存在A露r2基因表达的上调(具体数据文章尚未发表，详见2010江大学王宁博士毕业论文第二部分)。因为IVM过程的不良暴露影响的是具有全些IVMFl代发否影响其生殖系中相关基因的表达，保持并具传代效应，导致F2代出生小鼠的基因表达异常，产生影响2代健康的跨代效应令人关注。目前有研究显示：神经系统相关疾病，如Beckwith．Wiedemann综合(BWS)和Angelman综合症(AS)，在ART子代中有相应高发风险，这与子代印记基因的甲基化异常相关。本课题组先前的工作也发现了在IVM子代脑组织中印记基因表出现改变，这种改变是由其表观遗传修饰异常，即CpG岛甲基化出现异常所引起的(详见2010年浙江大学王宁博士毕业论文第三部分)。在表观遗传学中，基因的甲基化修饰为最常见的表观遗传学修饰。现如今关于印记基因以外的基因甲TV万方数据浙江大学硕士学位论文 序言基化研究已在辅助生殖领域广泛开展，考虑ART主要作用在配子和胚胎，ART程对DNA甲基化修饰造成的影响不可能仅限于印记基因，而应该是全基因组水平的，引发的基因表达改变将会因相关通路激活、静息或不同基因的相互调节而导致诸多后续或是传代影响。目前IVM相关的异常表型或异常基因表达的代间传递研究几乎空白，IVMF1代发育早期出现的神经活动配体．受体相互作用通路基因的表达差异虽然在F1代成熟小鼠脑组织中出现了纠正，但这些差异表达是否会传递至代被纠正及其涉及的相关机制仍然需进一步研究。本研究首次对IVM1鼠脑组织表达异常的前述八个基因在F2代神经系统中的表达及其传代效应进行了探究。我们通过随机分组，构建了IVM和体内成熟(invivomaRtration，VVM)对照组的近交系小鼠模型，以IVMF2代模型小鼠为研究对象，采用Real．TimePCR、焦磷酸测序和western．blot方法，研究IVM2组)基因表达、基因甲基化状态和蛋白表达状况，进行相应分子机理研究，分析关键作用环节，评估ⅣM所致的F1代神经系统异常表达的传代效应及ⅣMF2 生远期神经系统异常的风险。旨在为不孕不育家庭提供更安全、更经济的辅助生育技术，开展客观、有说服力的IVM儿子代长期安全性评估。V万方数据浙江大学硕士学位论文IVM鼠脑组织神经活动配达

中文摘要改变可父源性子二代基因表达异常浙江大学医学院硕士研究生导师

妇产科学(生殖内分泌)杨心运金帆教授中文摘要目的：研究IVM小鼠F2代脑组织神经活动配体．受体相互作用 (neuroactiveligand-receptorimeraction通路基因Gabra6,Glra，Gria4,Grid2,Agtr2,Slpr5,GallGrm4在代的表达情况以揭示上述IVMF1代新生期异常表达基因的传效应，并进一步研究F2代中Glral的甲基化状况及相应的蛋白表达情况。：1系C57BL／6J小鼠，通过单纯注射孕马血清获取未成熟卵，经体外成熟培养、ICSI辅助受精和胚胎移植等方法建立IVM小鼠模型。通过注射孕马血清和人绒毛膜促性腺激素获取成熟卵，经ICSI辅助受精和胚胎移植等方法建立VVM小鼠模型作为对照组，自然妊(naturalconceived，NC)小鼠为阴性对照组。三组F1代新生小鼠各取一只处死后获得脑组织运用MouseGenome4302．0芯片进行脑组织全基因表达谱分析，并通过进一步的Pathway分析提示神经活动配体．受体相互作用通路中Gabra6,Glral，Gria4,Grid2,Agtr2,Slpr工Galrl，Grm4基因表达差异最为显著。运用实时荧光定量PCR对上述F1代各组小鼠在新生及成年期都进行了验证检测，提示相比VVM组，IVM1代雄雌小鼠中以上基因均出现VI万方数据浙江大学硕士学位论文结了不同程度的上调，到成年后除结

中文摘要IVM雌性小鼠Agtr2基因表达仍上调之外，其余的基因表达异常均得到纠Y-(具体数据详见2010年浙江大学王宁博士毕业论文)。2．对上述F1代性成熟期各组雌雄小鼠两两1：1自然交配，得到相应的F2代。将F2代的类型分为IVM组[包括ⅣM+NC?(MN)，IVM8+IVM早(MM)，Nc8+IVM早(NM)]、VVM组[包括VVM8+NC早(IN)，VVM艿+VVM早(II)，Nc艿+VVM早(NI)]、C组[NC艿+Nc早]三大组，包括七个小组，每小组8只相应F2代小鼠。其中以NCF2代小鼠为阴性对照组。3．出生的2代小鼠饲养至0周时，进行水迷宫实验，记录各组小鼠的潜伏期及穿台次数(该部分数据课题组先前已完成，数据暂未发表，各组间小鼠学习、认知能力未见明显差异，具体数据详见2010年浙江大学王宁博士毕业论文)后分别处死获取各组小鼠的脑组织。．通过荧光定PC技术，检10周各组小鼠脑组织的神经活动配俗受体相互作用通路中相关基因(Gabra6,Glral，Gria4,Grid2,Agtr2，Slpr5,Galrl，Grm4)表达。．利用焦磷酸测序技术0周各组小Glra各位点的甲基化情况．通westerblo技术，检测各组小鼠脑脏组Glra蛋白的表达。果：1．IVM对F2代小鼠脑组织神经活动配体．受体相互作用通路各基因表达的影响与VVM组相比，ⅣM、F2代小鼠0周时，脑组织中Glral表达水平降低，差异具有统计学意义，其中以单一父源性因素影响最为明显(MN组F2代Glral表达量较IN组差异最为明显)。各组间2代小鼠脑组织Gria4,Grid2,Agtr2,Slpr5,Galrl，Grm4的表达差异无统计学意义。2．IVM对10周2代小鼠脑组织Glral甲基化修饰影响(1)比较组，IVM2代小鼠脑组织lrl的C2位点甲基化水平升差异具有统计学意义。与VVM小鼠F2代相比，甲基化水平也有升高，但未达异的统计学意义。IVM小鼠脑组织Glral的位点甲基化率相比VII万方数据浙江大学硕士学位论文NC组均有显著性升高，差异具有统计学意义。而小鼠脑组织组间无统计学差异。

中文摘要Glral其他CpG位点甲基化状态三(2)资料同时显示，单一性父源性因素对F2代小鼠脑组织甲基化率影响最为明显，在本研究进一步分析单纯IVM父源性小鼠所生子代(MY组)中Glral的甲基化状态相比单纯VVM父源性小鼠(IN组)在CpGl、C2位点明显升高，差异具有统计学意义。3．IVM对2代脑组织Glral蛋白表达的影响C组，10周IVM2代小鼠脑组织Glral蛋白表达水平降低，差异具统计学意义。但相比VVM组无明显统计学差异。其中从单一父源性因素对F2Glral蛋白表达的影响分析，通过对MNIN组蛋白表达进行独立t验，结果表明单纯IVM父源性小鼠所生子代(MN组)中Glral的蛋白表达量较VVM父源性小鼠(IN组)降低，差异具有统计学意义。结论：．IVM新生F1父源性小鼠脑组织神经活动配体．受体相互作用通路基因异常表达可导致F2代脑组织中的Glral基因表达异常。2．IVM新生F1代脑组织中神经活动配体．受体相互作用通路基因的表达异常虽然在其成年后大部分可以纠正，但M2中l的表达仍可出现异常，这可能是由于1代中异常表观修饰影响其雄性生殖系造成代间遗传导致的。3．IVMF2代小鼠虽然在表型上未见明显的神经系统及认知能力的发育差异，但存在潜在的神经系统疾病高发风险。尤其是父源性IVM F1代婚配可能对F2代的神经系统发育存在不良影响。关键词：未成熟卵体外培养技术，神经活动配体．受体相互作用通路，甲基化修饰，小鼠模型，传代效应VIII万方数据e浙江大学硕士学位论文 英文eAbrant geeexprssos ol一neuroactivellgancI—reCeptor"teraction pathwayinbrain。’malainoImale-line-erivedlinederived generationconceivedbyinvitromaturationDepartment ofReproductive EndocrinologyObstetrics&Gynecology SchoolofMedicine，ZhejiangUniversityCandidate Xinyun YangSupervisor Prof．FaJinAbstractobjetieToinvestigatetheexpressionofrelativegenesofneuroactiveligand—receptorinteractionpathway(Gabra6,Glral，Gria4,Grid2,Agtr2,Slpr5,Galrl，Grm4)inIVMF2mice，andtoexplorethetransgenerationaleffectofthedifferentialexpressionofthesegenesinnewbornF1IVMmice．MoreovegtoilluminatetheepigeneticmodificationofGlralandGlarlproteinexpressioninbrainsofF2IVMmice．Materialsandmethods：Toobtainedimmatureoocytes(GVoocytes)aftertheinjectionofpregnantmareserumgonadotropin(PMSG)inC57BL／6Jmice．ThenweculturedtheGVoocytestoMIIstageoocytesOVMoocytes)invitro。Menhl，wegotinvivomatureoocytes(VVMoocytes)afterthenjectionofPMSGandhumanchorionicgonadotrophin(HCG)inC57BL／6Jmice．BothIVMoocytesandVVMoocyteswerefertilizedbyICSIandtransferredtopseudopregnantICRmice，respectively．FirstfilialgenerationmicemodelIX万方数据浙江大学硕士学位论文 英文摘要ofIVMwasestablished．Thengenechiparray(mousegenome 4302．0)wasusedfortheanalysisfegeneexpressioninthebrainsofnewborn F1mice．ThefurtherPathwayanalysisrevealthattheexpressionofgenes(Gabra6,Glral，Gria4,Grid2,Agtr2,SlprS,Galrl，Grm4)inneuroactiveligand-receptorinteractionpathway werethemostsignificantlyaltered．Thereal—timePCRwasusedtodetecttheexpressionofthesegenes．Thesegeneswere allup—regulatedinnewbom F1mice，butmostofthesedifferentialgenesrecovered until10wstageexceptAgtr2werestillup—regulatedinfemalemice．2．AftermatingeachotheramongdifferentgroupofF1mice，theF2micemodelwasfounded，classifiedasIVM，VVMandNCgroup．IVMgroupinclude：IVM(罗+naturalpregnant早(MN)，IV艿+IVMg(MM)，naturalpregnant8+IVM早(NM)；VVMgroupinclude：VVM8+NC早(I)VVMc了+VVMg(II)c艿+VVM早(NI)NCgroup：NC艿+NC9Eachgrouphas8samples．VVMgroupwasusedasthecontrolgroupandthenaturalpregnantmicewereusedasthenegativecontr01．3．Thespatiallearningandmmorycapabilityofsecondfilialgenerationwasdetectedbythewatermazetest．Theincubationperiodandthetimesas theplatformwererecordedin10weekstages(thedatawasfinishedbyourresearchgroupandthedatahavenotbeenpublished．Theresultindicatedthattherewasnodifferentbetweenthespatiallearningandmemory capabilityofthesegroups)．Thentheeachgroupmiceweresacrificedat10wrespectively．4．Theexpressionsofrelativegenesofneuroactiveligand—receptorinteractionpathway(Gabra6,Glral，Gria4,Grid2,AgtrZ Slpr工Galrl，Grm4)weredetectedbyusingreatimequantitativePCRineach10wF2micegroup．5．ThmethylationstatusfnelGlral genesmeassuredbypyrosequencing in10wF2mice．6．TheGlralproteinin10wmicebrmnsoftheabovegroupsweredeterminedbyWestemblot．X万方数据n浙江大学硕士学位论文 英文摘要nResult(s)1．EffectsofIVMon theexpression levelsofrelative genesofneuroactiveligand—receptorinteractionpathwayn2e．WhencomparedtoVVMandNCsecondfilialgeneration at10wperiod，Glralshowed significantlydown—regulatedinIVMgroupandnosignificantdifferenceswerefound in，Gabra6,Gria4,Grid2,Agtr2,Slpr5,Galrl ，Grm4．Thesinglepaternaltransgenerationaleffectsisremarkabletherein(theGlralexpressionsofMNoffspringissignificantlydown—regulatedcomparedwithINg．2．Effectsof!VMontheDNA(1)Whecomparedto

methylationVVMsecond

statusofneuralGlralfilialgenerationat10w

inF2mice．period，neuralGlralofⅣMF2offspringshowedhighermethylationrateinCpG6sit．InCpG2ⅣMwassignificanlyhighermethylatedthanNCbutnostatisticaldifferencescpedtoVVMNoanotherffces werfoun inCpGitesfGlralamongabovethreegroups．(2)ThesinglepaternalfactoraffectedthemethylationstusofneuralGlralF2micesignificantlInthisstudy,themethylationstatusofsingleIVMpaternalsecondfilialgenerationalmice(MN)weresignificantlyincreasedcompare tosingleVVMpaternalsecondialgenerationalmice(IN)iCpGl，CpG2site．3．EffectsofIVMontheneuralG|ralproteinin10w—F2miceWhencomparedwithNCF2offspring．theGlralproteinlevelwasexpressedatlowerlevelinIVMmicebraintissueatageof10w．Hwever,there werenostatisticallysignificantdifferencesbetweenIVMandVVM．Furthermore，throughtheindependent-ttestbetweenMNandIN，singleIVMpaternalsecondfilialgenerationalmice(MN)havesignificantlowerGlralproteinexpressionsthansingleVVMpaternalsecondfilialgenerationalmice(iN．Conelusion：万方数据e浙江大学硕士学位论文 英文摘要e1．Thealteratedexpressionofrelativegenesofneuroactiveligand—receptorinteractionpathwayinbrainofIVMF1newbornmicecouldchangethecerebralgeneexpressionofthemale．1ineF2mice．2．ThedifferentialexpressionofGlralgeneinIVMF2micebrainmightbecausedbytheepimutationinheritancfrommale-lineIVMF1mic．3．TheneuralphenotypeofIVMsecondfilialgenerationmicehavenodifferencescompetoVVMorNCsecondfilialgenerationmice，buttheymaypossesshigherrisksofneuraldiseasemorbidity．Especially,theIVMpaternalfactormaycausetheharmfuleffectsforIVMsecondfilialgenerationoffspring．Keywords：in-vitrooocytesmaturation，neuroactiveligand—receptorinteractionpathway,methylation modification，geneexpression，secondfilialgenerationmousemode，transgenerationaleffectsXII万方数据ac4塑望奎兰堡主堂垡堡塞 ac4缩略词表————————————缩略词 英文全称 中文全称AI盯 assistedreproductivetechnologies 辅助生育技术IVF．ETinvitrofertilizationandembryotransfer体外受精．胚胎移植IVF invitrofertilization 体外受精ICSI intracytoplasmicsperminjection 卵胞浆内单精子注射IVMinvitromaturation体外成熟GV germinalvesicle 生殖泡MII metaphaseII 减数分裂中期PMSG pregnantmareserumgonadotropin 孕马血清HCG n chorionicgonadotrophin 人绒毛膜促性腺激素HTF HumanA西alFluid 人输卵管液PAGE plaregeleectrs 聚丙烯酰胺凝胶电泳EDTAethylenediainetetraceticacid乙二胺四乙酸PMSF plethylsulphonyl fluoride 苯甲基磺酰氟Gabra6 ganma’inobu‘yricdrecep‘subunit 氨基丁酸受体亚单位 6alpha6Glral glycinereceptor,alpha1subunit 甘氨酸受体亚单位1gluateGria4 receptor,io．otropicAMPA4谷氨酸离子门控受体亚单位一一。一’(alph、Grid2 glutamaterecpto,inotopic，delta2 谷氨酸离子门控受体亚单位2Agtr2angiotensinIIreceptor,type2 血管紧张素112型受体基因Slpr5 sphingosine--1．-phosphatereceptor5鞘氨醇磷酸受5Galrlgalaninreceptor 促生长因子神经肽受体1Grm4 glutamatereceptor,metabotropic 4 代谢型谷氨酸受体亚单位 4————————————————一万方数据目次射 I序言 ．II中文摘要 vI英文摘要 Ix缩略词表 ．．XlII目次正文引言 11材料和方法 42实验方法 73结果 234讨论 295结论 33参考文献 ．．：．．． ．34综述 38作者简介 50万方数据能力的发育以及精神相能力的发育以及精神相IM小神受改变可导致父源性子二代基因表达异常浙大学院硕研生导师

妇科学(生殖内泌)杨心运金帆教授1978年，罗伯特·爱德华兹(RobertGEdwards)首次运用IVF。ET成功使不孕病患诞下首例试管婴儿。至此之后，ART技术揭开了新的篇章，相应衍生技应运而生。其中IVM是ART的衍生技术之一，于1991年开始应用于临床实践幽。其主要适用于在ARTOHSS高风险的不孕患者，尤其是PCOPCOS的不孕患者幽。IVM过程涉及了脱离卵巢内环境外培养成熟的过程，涵括了IVF-ETICSI的所有体外操作。这些暴露都发生在配子及胚胎表观遗传重编程的重要阶段嘲，有研究表明这些阶段的IVM过程可影响卵母细胞成熟过程中发生的基因印记的重建擦除，出现染色质的重新构建和纺锤体结构异常圈，导致表观遗传改变，引发相应疾病的发生图。同时随着“胎儿源性疾病学说”回及“胎儿发育编程传代效应学说【2，翻的提出，结合目前有关ART出生几安全性的研究报导逐渐增多，ART引起的子代不良影响是否具有传代效应及其长期安全性的问题引起研究者的关注。迄今为止大部分关于ART子代安全性相关的报导提示ART的子代在智商、认示ART女婴的神经系统及认知能力发育异常的发生率要高于自然女婴[丝]。IVM作为其的一个衍生技术，其子代虽有智能或心理运动发育指数降低、学习和语言万方数据在动物实验中，有研浙江大学硕士学位论文 正文引在动物实验中，有研障碍的个别病例报告，但因样本量有限，尚无统计学意义显著性差异发现匝究提示虽IVM F1代在脑发育及认知能力上较自然妊娠的代未见明显异常，但在脑组织中现了神经系统疾病相关基因，Armet和Mrlp51表达的异本课题组的ART动物模型前期实验表明，IVM出F1代小鼠脑组织存在多个基因的表达异常和脑组织中印记基因的DNA甲基化修饰改变(详见20江大学王宁博士毕业论文第三部分)。这可能与IVM过程中的体外操作及胚胎早期发育环境的改变影响卵母细胞和植入前胚胎表遗传重新编程的进程有关。胚胎发育早期因环境因素变化造成的异常改变，会通过传代效应遗传给F2代，而甲基化修饰的异常改变正是发育编程的传代效应的重要哑，竖IVM子代间可能存在表观遗传学修饰的遗传。与之相佐证的是，目前在植物及动 物模型的实验中发现表观突变的代间传递可以引起相关表型特征的非孟德尔式遗传。哩，垫】目前世界上首例IVF出生儿LouiseBrown及同为F和IVF—ET生育了后代，全球首批试管婴儿也陆续开始进入婚育时期。ART对人类的影响将可能跨代在F2代中显现出来，尤其是目前在F1代的研究中发现的存在的异常是否存在传代效应，神经系统及认知能力的相关差异是否会遗传至2代成T的跨代的影响都是有待解决的问题。迄今就IVMF2代的远期安全性研究几乎是空白。本课题组先前的实验提示F1IVM小鼠在认知学习能力的表型测试上未见明显差异。但通过应用Affymetrix公司的MouseGenome02．0，对IVM代的脑组织全基因表达谱进行分析显示共96个差异基因对芯片的结果进行分析，提示这些基因的调控差异指向与神经元细胞分化的负向调节(negativeregulationofneurondifferentiation)有关；进一步的pathway分析发现，差异最显著的是神经活动配体．受体相互作用(neuroactiveligan—receptorinteraction)通路；目前有研究提示该通路的异常可能与帕金森的发病有一定关系[丝]。该通路总共有291个基因，其中发现在IVM1代中神经活动配体一受体相’万方数据浙江大学硕士学位论文 正文引言作用(neuroactiveligand．receptorinteraction)通路中的八个基因(Gabra6,Glral，Gria4,Grid2，Agtr2，Slpr5，GalrI，Grm4)存在表达差异：1与VVM及NC组相较，IVM新生F1代雄性小鼠以上基因表达均呈不同程度上调；lOw时，IVM雄性小鼠上述8个基因表达均趋于正常。 2与M 1代雌性小鼠Gabra6,Glral，Gria，rS5l4均呈不同程度上调；而与NC组比较，Gabra6,、Gria4,Slpr5表达呈不同程度下调状态；10w时IVM雌性小鼠除Agtr2基因表达上调，其余基因表达均趋于正常(具体数据详见2010年浙江大学王宁博士毕业论文第二部分)。这些早期工作提示IVM出生的子代在其新生时候可能出现神经活动配体．受体相互作用通路基因的表达异常。然而这种异常大部分可以在小鼠成年后纠正，未观察到表型的改变，这可能与在幼鼠生长发育过程中亦存在表观修饰的重新编程有关。另外，根据胎儿发育编程的传代效应圈，胚胎发育早期因环境暴露变化可能对子代生殖系造成异常改变，虽然在发育过程中部分异常表达可以被纠正，但仍有可能会通过传代效应遗传给F2代。其中最典型的例子是研究发现1944～1945年荷兰大饥荒中营养欠佳孕妇的孙代出现围产期并发症和生育低体重儿的发生率明显升高，即使其子代并非低出生体重儿[丝]。这意味着胚胎发育早期的不良因素暴露可能会出现隔代的不良效应。故本研究通过构建IVM及其对照组小鼠F2代模型，探究IVMFl代新生小鼠中出现的神经活动配体．受体相互作用通路中差异表达的八个基因在F2代成年小鼠脑组织中的表达情况，阐明其传代效应及相关机制。万方数据浙江大学硕士学位论文 正文材料和方法1材料和方法11实验动物体重约229的8周C57BL／6J雌性小鼠及C57BL／J体重约289的8周雄性鼠。生育期体重259的8周ICR雌鼠，体重289的8周雄鼠，2／h循环，自由饮食，恒温饲养。实验动物购买并且饲养于浙江大学实验动物中心1．2仪器1实验所用仪器4万方数据浙江大学硕士学位论文 正文材料和方法．3试剂表2体外培养及操作所需主要试剂试剂 产mHTF(modified humantubalfluidmedium) 美国Irvine公司HTF“umantubalfluidmedium) 美国Irvine公司10％合成血清(sertlmsubstitutesupplement)美国Irvine公司hCG(humanchorionicgonadotropin)浙江动物制药厂PMSG(pregnantmareserumgonadotropin)矿物油

浙江动物制药厂美国Sigma公司，RNAisoTMPlus 日本TaKaRa公司PrimeScriptTMRTreagentKit 日本TaKaRa公司SYBRPrimixExTaqTMKit 日本TaKaRa公TaqTMExHotStart 日本TaKaRa公EpiTect亚硫酸盐处理试剂盒 美国QiagenPSQ96焦磷酸测序试剂盒 iagen公Streptavidin—coatedsepharosebeads 瑞典GEHealthcareRabbitati．Glralantibody：AB．15012美国Millipore万方数据 5浙江大学硕士学位论文 正文材料和方法表3需用的试剂配方试剂名称 配方提取裂解液 3．659EDTA溶于90ml水中，用10mol／L，DNANaOH调H值至8．0，加水定容至100ml。取102．69NaAc．3H20于200mldH20中，冰醋酸调PH值至5．2，3MNaAc 定容至250ml，高压灭菌。Tris1219NaCl1179EDTA0292gTween20lml先用900buffer， Milli．Q(18．2MQXcm)的水溶解这些化学试剂，再用．

mlBinding1MHClpH7．6 调pH至7．6，最后用水定容至1000ml。Tris2．429，乙酸镁0．439，先用900mlMilli-Q(18．2MQcm)的1XAnnealing 水溶解这些化学试剂，再用．4MC调H至7．6，最后用水定buffer，pH7．6 容至1000ml。交性液0．2MNaOH8g，用Milli—Q(18．2QXcm)水定容至1000ml。NaOHWashingbuffer， Tris1．219，先用900mlMilli-Q(18．2MQXcm)的水溶解，再用．pH7．64MHAC调pH7．6，最后用水定容至1000ml。将6．7ml的HCl(37％)首先加至160ml的水，1MHCl 再用水定容至200ml。将45．8m1的无水HAC首先加至140l的MilliQ(18．2MQXcm)4MHAC 水，再用水定容至200ml。6万方数据浙江大学硕士学位论文 正文实验方法2实验方法21小鼠未成熟卵体外培养、卵泡浆内单精子注射、胚胎移RTF2代的获取2．1．1建立IVM及VVM1代模型将6．8周龄C57BL／J雌性小鼠，随机分为IVM、VVM及NC组(阴性对照)。同一品系10周龄雄性小鼠，饲养于相同的条件；2．1．1．I卵母细胞获取及培养(1)IVM卵母细胞的获取1)予C57BL／6J雌性小鼠腹腔注射7．5UPMSG超促排卵，48h后将其脱颈处死，解剖取卵巢置于mHTF液中在解剖显微镜下定位半透明的卵泡，用1ml注射器将其刺破，予移液枪获取V期卵母细胞。2)取GV期卵母细胞培养于10％血清的HTF培养液，o．5IU／mlhCG，0．1IU／mlFSH，0．05mg／mlpenicillin，20ul微滴，以矿物油覆盖，置于370C， 5％C02培养箱16．18h过夜(培养基均需提前一天置于370C，5％C02培养箱平衡过夜，以下均同)。3)在显微镜下检选成熟MII期卵母细胞(第一极体排出)，置于mHTF(含有透明质酸酶)吹打1min，去除颗粒细胞。将第一极体清晰可见的卵母细胞移新的mHTF液中，待受精。(2)VVM组卵母细胞的获取1)VVM组C57雌性小鼠腹腔注射7．5IUPMSG，46．48h后腹腔注射hCG7．5Iu。2)13．15h后脱颈处死，剪下输卵管部，置于mHTF液中，予小针头撕开输卵管壶腹部，在显微镜下检选取成熟的MII期卵母细胞，剔除颗粒细胞(方法同ⅣM)。3)将第一极体清晰可见的卵母细胞移入新的 微滴中，待受精。2受精和胚胎培养，受精方法采ICSI技术：万方数据浙江大学硕士学位论文 正文实验方法(1)卵子的准备如上述。(2)精子的准备(采集与获能)1)将0C57BL／J雄鼠脱颈处死，切开腹部，分离切下附睾尾，置于mHTF培养液四孔板中，在附睾尾膨大部用1l注射器针头划几个小口，沿破口挤压附睾，将精子挤出。2)将精子置于37。C，5％C02培养箱10min使其获能，收集上部具有活力的精子，将其转移至另一个新mHTF培养液中，用于ICSI操作。(3)ICSI操作程序)显微操作系统的安装分别将持卵针和注射针安装到显微操作仪的固定针操作臂和注射针操作臂上，再将操作臂安装至压电驱动装置上。2)准备ICSI用培养皿：将PVP及mHTF液滴按一定顺序排列于ICSI培养皿上，矿物油覆盖。3)精子头与尾的分离a．在第一滴PVP液滴中加入1“1新鲜精子悬浮液并充分混匀。b．从第一滴PVP10个或更多有活力的精子移到第二滴PVP液滴中。c．用注射针伸入PVP液滴中，对准精子尾部将其吸入，而注射针开口处正好对准精子颈部(精子头与尾的连接部位)。．适量压电脉冲使精子头尾分离。将精子头推出吸管，置于第三个PVP液滴中，同法处理下一个精子。e．在ICSI之前，将10个左右断尾的精子头吸入注射针中。f．当管内的精子头用完后重复以上步骤。)精子注入卵子a．用持卵针将卵子轻轻固定(将中期纺锤体放置在6点或者12点的位置，第一极体通常位于中期纺锤体附近，所以它可以作为中期纺锤体位置的一个标记)。b．当注射针的针头与卵子透明带接触后，在应用压电脉冲给一个轻微的负压的同时给针一个向前的推力。R万方数据浙江大学硕士学位论文 正文实验方法C．当注射针头穿过卵透明带时，在卵周隙处将透明带的柱状碎片排出。d．将管中的精子头向前推直到它接近注射针头。e．将注射针迅速刺向卵子直到其针头接近另一侧透明带，给以1．2次压电脉冲注射针头穿透卵质膜上。￡将一个精子头(尽量少的精子悬浮液)注入到卵胞质中。将过量注入的精子悬浮液吸出，然后同时迅速将注射针抽回。．对所有卵子重复以上程序．注射完成后，将卵子移入到石蜡油覆SOM培养液中，置C03培养箱中。i．ICSI操作后大约1h，检查卵子的成活情况，弃掉退化的卵子。j．将存活的卵子移入到新鲜的20 l的KSOM培养小滴中(每滴约10枚卵)置于5％C02，37。C培养箱中继续培养。ISI完成后4-6 ，检查具有发育两个原核和第二极体的卵子的数量3胚胎移植2细胞期胚胎假孕小鼠的胚胎输卵管内移植。(1)麻醉剂的制备在玻璃锥形瓶592-trobromoethyalcohol(sigmaT4840)乙白色固体粉末)溶解在5ml的tertamylalcohol(sigma240486)叔戊(液体)可用40C水浴热以促进溶解。三溴乙醇粉末完全溶解后，加入195ml生理盐水022uin过滤菌后分装，4℃保存备用。(2)雄鼠输精管结扎术准备1)为10周以上生育能力正常的雄性ICR小鼠称重，腹腔注射适量麻醉剂o．02ml／g(重)。2)将小鼠腹部向上放在手术盘中，先将腹部手术区备皮，75％乙醇腹部消毒。3)剪开腹部皮肤至下肢上端水平线位置，1切口，睾丸附睾和输精管也将被一同拉出。

cm横切口。用钝性小镊子将一侧的睾丸脂肪垫拉出镊子酒精灯上烧红后，用其钳夹输精管将其烧断。9万方数据小鼠浙江大学硕士学位论文 正文实验方小鼠小心将睾丸附睾、输精管及脂肪垫放回腹腔对另一侧睾丸和输精管处理同以上两步分层缝合腹腔及皮肤。将术后NJJ,鼠放置3C热台以防麻醉期低体，待苏醒后放回干净的鼠笼周后将结扎雄鼠与生育期雌鼠合笼，雌鼠若见阴栓但未怀孕者，可用于作为假。(3)假孕小鼠准备1)阴道涂片观测8周具有生育能力的R鼠(259以上)的动情周期，于发情"-3天与输精管结扎雄鼠合笼1：1或2：)。)若合笼第二天合笼雌鼠阴道口见阴栓，可用于输卵管移植。(4)输卵管内胚胎移植)交配后0．5天，对ICR假孕雌鼠进行腹腔注射适量麻醉剂。2)将小鼠置于垫有纱布的37。C热台上，行显微镜下操作。3)将2细胞胚胎吸入移植管。a．吸入胚胎前先在移植管内吸入少量mHTF培养液，然后吸入一个小的气泡。b．将胚胎吸入移植管，吸入的胚胎加培养基高度大约5。7min，在移植管的末端再吸入一个气泡，待输卵管胚胎移植。4)暴露ICR受体鼠的输卵管准备移植背部去毛5％酒精消毒。在最后肋骨背中线处皮肤上剪一个小口，75％酒精棉球擦洗创口，以便去除脱落的毛发。尽量暴露手术视野，以便找出卵巢、输卵管和脂肪垫。5)胚胎移植：a．用钝头镊子夹住脂肪垫并将其牵出体外，予小弹簧夹子固定脂肪垫，将卵巢、输卵管暴露与体腔外。b．将小鼠连同培养皿一起放到立体显微镜下。C．在显微镜下，用两把镊在输卵管伞部的卵巢囊上撕开一个小口，找到输卵管伞端开口。1n万方数据浙江大学硕士学位论文 正文实验方法d．用钝镊子小心的夹住输卵管伞，将移植管顺着输卵管开口子宫的方向插入输卵管开1：3，并将胚胎及气泡吹入输卵管壶腹部。若在输卵管内看到气泡，就说明移植已成功。e．松开小弹簧夹子，用钝镊子将脂肪垫，将子宫、输卵管和卵巢等放回体腔。缝合体壁及皮肤。￡根据实际需要及可用胚胎数量，可重复以上c，d，e三步，将胚胎移植到对侧输卵管。g．术后将小鼠置于37。C热台上保持小鼠体温，待苏醒后放回干净的鼠笼。h．待IVM及VVM组小鼠产下相应组别的1代小鼠，称为IM F1代及VVM F1代小鼠。ARTF2代及其脑组织的获取(1)ARTF2代获取及分组待上述两组F1IVM，VVM及C组小鼠性成熟期后以雌雄小鼠两两1：1自然交配，得到相应的F2代。以ⅣMF2代为研究对象，以VVMF2代为对照组，同时设立NC组为阴性对照组。我们将F2代的类型分为IVM组：包括IVM艿+NC9(MN)，ⅣM艿+IVMg(MM)，Nc艿+IVM早(NM)VVM组：包括VVM艿+NCg(IN)，VVMc罗+VVMg(II)，NCc了+VVM9(NI)；NC组：c艿+NC9(NC)--(流程如图1)。其中再细分为7个小组，每组8只相应F2代小鼠(表4)。l鋈蒺il夔鬻震攀羹麟荔饔图1F2代小鼠获取流程图万方数据浙江大学硕士学位论文 正文实验方法(2)各组F2代小鼠脑组织的获取在各组小鼠10周时将各组F2代小鼠脱颈椎处死，取F2代小鼠全脑组织，予液氮急速冷冻后置C冰箱保存。22IVMF2代lo周小鼠学习能力测定(课题组先前已完成，详见2010年浙江大学王宁博士论文)(1)Morris水迷宫实验系统通过向圆形铁皮水桶注水至深约为30—40cm，将圆形平台藏匿于2cm的水面之下。水中加入适量的奶粉，使水池成为不透明的乳白色。(2)实验训练阶段连续进行d，每天定时训练4次。第1天为初训体验期，目的是让小鼠适应环境。将小鼠面向池壁从四个入水点(在圆桶的上缘等距离地设东、南、西和北4个标记点，作为动物进水池的入水点)分别放入水池，记录小鼠从入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需时间，作为潜伏期，用秒(S)表示，测量小鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力。小鼠找到平台后，让其在平台上站立10s。若入水后70s小鼠未能找到平台，则将其轻轻从水中拖上平台，并停留10s，然后进行下一次训练。每只小鼠从四个入水点分别放入水池为一次训练，两次训练之间间隔30s。(3)第2天开始为正式训练期，为定位航行实验。步骤同上，但时间改为入1’万方数据浙江大学硕士学位论文 正文实验方法水后60s小鼠未能找到平台，则将其轻轻从水中拖上平台，并停留10s，然后进行下一次训练。每只小鼠从四个入水点分别放入水池作为一次训练，两次训练之间间隔30。(4)空间搜索实验，测试对平台空间位置记忆的保持能力。第7天，撤去平台，从同一个入水点放入水中，测其第一次到达原来平台位置的时间、穿越原来台的次数。(5)数据导出分析。2．3 F2代小鼠脑组织总RNA提取和逆转录2．3．1脑组织总RNA使用TAKARA公司的RNAisoTMPIus试剂对脑组织总RNA进行提取，具体操作参照说明书进行。所使用的器皿和器材均RNAfree。(1)将液氮冻结的IVM、VVM及NC各组小鼠的端脑组织取绿豆大小迅速转移至1l的离心管，并添加1mlRNAisoTMPlus，用匀浆机将各组标本充分匀浆。(2)将匀浆液转移至离心管中，室温静置5min。(3)向上述匀浆裂解液中加入200ml氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15S，待液体充分乳化(无分相现象)后，室温静置5min。(4)离心机120009，4℃，离心15min。(5)从离心机里小心取出离心管，此时匀浆液分为无色的上清液，中间的白色蛋 白层及带有颜色的有机相下层。吸取最上层的上清液转移至另一新的1．5ml离心管中(勿吸出中间白色层)。(6)向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，冰上静置10mi。(7)离心机120009，4"C，离心10min。(8)小心弃去上清，缓慢的沿离心管壁加入7％乙醇1l，上下颠倒洗涤离心管

管辟口=o(9)离心机120009，4℃，离心15rain。弃去上清。万方数据浙江大学硕士学位论文 正文实验方法(10)室温干燥2．5min，入3lRnase．free水溶解沉淀，可以用移液枪轻轻打沉淀。(11)测OD值，要求A260／A280=1．8．0，计算RNA浓度RNA可保存于80。C。2．3．2逆转录合成cDNA(1)基因组DNA去除5反应体系成分5xPrimeScriptTMBuffer(forRealTime) 4PrimeScriptTMRTEnzymeMixI 1RTPrimerMix 1RNAsampleafterDNasetreatment 10RNaseFreedH20 upto20肛1反转录反应条件如下：37℃5in5S．20。C保存备用2．4荧光定量PCR检测各组小鼠在10w(性成熟期)脑组织中的神经活动配体．受体相互作用通路各相关基因的表达。(1)mRNA的反应方式14万方数据浙江大学硕士学位论文 正文实验方法109l的PCR反应体系，按下列组份配制反应液(在冰上进行配制反应液)。real．timePCR反应体系NM一001099641．1 Gabra6．F AA CCGCAGabra6．R AA AAGCNM020492．3 Glral．F GACCTGAGATACTGCACCAAGCACGlral．R TCCAGGACAGGATGACGATGAGNM001113181．1 Gria4．F ACGCCCATGGTGACGAAACTAGrim．RNM008167．2 Grid2．FGrid2．R

CAAGACACCATCGTAAGTGAGAGCATCTGGCAACCCGAATG√^TGACTGTTTGCTTGGACAGATCCTGAANM007429． Agtr2-F GTGCATGCGGGAGCTGAGTAAgtr2一R J蛔盯GGTGCCAGTTGCGTTGANM053190．2 Slpr5-FGCTCCAAGAATGCTCAGAACCAGSlpr5一R TCCAGAGCCA AATTTCCAGACCNM一008082．2 Galrl．F CCTTGTATGAGalrl．R． AGTTGCTGl ：ATGCCAGGCAATGNM001013385．1 Grm4．FGrm4-R

GGCTGAAGGTGCAGTCACCACAGATGTTGCGCCTGTTGTTGNM008084 Gapdh—FGapdh—R

TGTGTCCGTCGTGGArCTGATTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG万方数据浙江大学硕士学位论文 正文实验方法2．5 IVM对10wF2代小鼠脑组织Glral甲基化状态的影响2．5．1基因组DNA提取(1)将液氮冻结的各组小鼠的脑组织取绿豆大小，同时迅速转移至1．5ml离心管中，迅速添加400“l裂解液，用匀浆机将各组标本充分匀浆。(2)1加入蛋白酶K6Ixl(20mg／m1)，混匀。(3)5C水浴2，每10min震荡一次。(4)加等量氯仿，剧烈混匀15S，冰上静置5min。(5)室温12000rpm，离心10min(若上清较浑浊，室温静置30min，再次离心。(6)吸取上层水相至新管(4-6可视情况重复一次)。(7加1／10体积的醋酸(PH5．2，3mol／L)，混匀，加2．2．5倍体积的冷无水乙醇，混匀，冰上30min。(8)室温12000rpm，离心10min，弃上清。(9)加70％乙醇500．1000gl，混匀。(10)室温12000rpm离心10min弃上清复一次。(11)晾干后加500txl的3dH20溶解DN80C冰箱保存备用。2．5．2基因组亚硫酸氢盐修用Q!△鱼斟公司EpiTectBisulfiteKits对llxg基因组DNA进行行亚硫酸氢盐修饰，产物立即使用或．80。C保存待检。(1)解冻DNA。根据需要溶解BisulfiteMix，每份加800斗lRNase．free水，涡旋至全部溶解。(2)根据下表8，在200glPCR管中准备亚硫酸氢盐反应。按照表中列出的顺序依次添加。(3)盖上PCR管，混匀反应物，将管置于室温(15—5。)。)10设置一个热循环程序。整个循环需要约h。(5)将装有亚硫酸氢盐反应的PCR管放入热循环仪，开始热循环孵育(6)亚硫酸氢盐转化完成后，简单离心，然后将全部亚硫酸氢盐反应转移到干净万方数据浙江大学硕士学位论文 正文实验方法的5ml微量离心管中。(7)将新配的560}，l有10ug／ml载体RNA的BufferBL加混匀，然后简单离心。(8)根据需要的数量，准备EpiTect Spin柱和收集管置于架子上。将步骤7每个管中所有混合物转移至相应EpiTectSpin柱。(9)12000rpm离心Spin柱1min。弃滤液，将Spin柱放回收集管中。(10)将00H1BufferW加入每Sn柱中，0n，弃滤液，Spin柱放回收集管中。(11)将500山r加入每个Spin柱中，室温(15—25℃)孵育15min。(注：为避免空气中C02酸化，放BufferBD的管使用后必须马上盖上。预热前Spin柱需合上盖子)(12)12000rpmn柱lmn。弃滤液，将Sn柱放回收集管中。(13)将500¨lBufferW加入每个pin柱中，最高速离心1min。弃滤液，将pin柱放回收集管中。(14)重复步骤3一次。并提前将BufferB于56。C的水浴锅中预热5min。(15)将Spin柱放入新的2ml收集管，12000rpm离心lmin以除去残留液体。(16)将打开盖子的Spin柱放到入净的1．5“微量离心管中。(17)将20“l预热的BufferEB加到Spin柱的膜中央。0m心1，洗涤纯化的DNA。表9亚硫酸氢盐反应体系成份 体)DNAsolution(1pg299) Variable*RNase．freeⅥ，矩erBisulfiteMix(dissolvedstep1

V打iable*85DNAProtectBuffer 35TotalVolume 140木DNAsolution+RNase—freeWater=20rtl17万方数据浙江大学硕士学位论文 正文实验方法2．5．3PCR扩增(1)PCR引物序列的设通过Methyprimerv1．1软件预测Glral启动子区CpG岛并设计其扩增引物(如图2)图2Methyprimervl．1软件预测Glral启动子区CpG岛结果3CpGisland(s)werefoundinyoursequenceSize(Start—End)Island1 104bp(61—164)Island2151bp(326-476)Island3 182bp(681—862)1R万方数据浙江大学硕士学位论文0℃．50℃ 45sI选0℃．50℃ 45sI表

正文实验方法BSPGenes Primerqee5-3)GrlForward

A眦ATTTATGAAAGAAAGAAAAGAAGA AAReverse．biotin ATTACAACCA AACAACTA AAATACC注：而采用焦磷酸测序时，上下游引物其中一条需要用生物素标记，合成方式则用HPLC纯化。(2)降落PCR反应体系12降落PCR反应体系成分 体积(91)l0宰PCRBuffer )dNTPMix(各2．5m) 4模板DNA 2上游引物(10gM)下游引(1)

11ExTaq热启动酶5IU／91) 0．25灭菌蒸馏水 upto50(3)反应条件：降落PCR：预变性94。C5min94P6每个循环．5℃)72℃ 45s94℃ 30S

30s’、>J20cycleS]50。C 45s 30cycles7。C 45s72。C 10rain

19万方数据浙江大学硕士学位论文 正文实验方法(4)PCR扩增产物于1．5％琼脂糖凝胶(含溴化乙啶0．5g／)中，100V，20rain电泳检测。2．5．4BSP产物的焦磷酸测序验证(Q24)(1)在PCR板中，准备微珠预混液配制(每管)Beads：2m+BindingBuffer：40山+模版：10山+ddH20：281al；混匀后震荡20min。(2)焦磷酸测序样品准备1)清洗探头2-3次，最后一次将探头竖直举起，抽出残余水分，将70％乙醇、变性液NaOH、洗液Washingbuffer倒入相应的位置2)加入碱基和酶、底物，将试剂仓放入仪器(如图3)E A ST CG图3Brand(Q24)加样示意图(E：酶；S：底物；ATCG代表相应的碱基))标版中，准备预混液(每管)：AnealBuffer：24¨1，测序引物(10M)：1肛1。根据目的测序序列经PyroMarkAssayDesign设计测序引物(表13)：13测序引物序列4)探头吸附微珠预混液：将探头分别顺次放置于70％乙醇5s，变性液NaOH5s，WashingbufferlOs，看到液体从管中出来，探头竖直举起直至水抽干；将探头对准酶标板，关闭真空，停留3S后，探头置入酶标板，轻轻晃动探头；将酶标板放置于80。C2min，室温直至手感不热，放入仪器。5打开焦磷酸测序仪的甲基化分析软件，设置相应的分组及对应名称，件。，n万方数据浙江大学硕士学位论文 正文实验方法2．6 IVM对ARTF2代10W脑组织中Glral蛋白表达的影响1组织蛋白质的提取采用总蛋白提取试剂盒(含ProteaseInhibitorCocktail)进行6个样品总蛋白的提取，然后采用BCA定量试剂盒进行总蛋白定量。2．6．2SDS．PAGE电泳分配制1％分离胶％浓缩胶，每个60ug总蛋白进行上样，每115u，浓缩胶60，分离80V进行电5 11r左右。(1)1SDPAGE凝胶的制备：安装玻璃板，灌注分离胶至梳齿 c。在胶溶液上方覆盖无水乙醇，．防止氧气扩散进入凝胶抑制聚合反应。待分离胶聚合完全后(约30min)，制备5％PAGE浓缩胶，倾出分离胶上面的水分，灌注浓缩胶，插上梳子。待浓缩胶聚合完全(约30min)后孔及凝胶底部，去除未聚合的丙烯酰胺。将凝胶固定在电泳装置上，上、下槽均入lxTriS甘氨酸电泳缓冲液，排除凝胶底部两玻璃板之间的气泡。(2)上样：微量加样器顺序加样，每板胶均设预染蛋白质Marker同时上样。样品蛋白均已稀释成同一浓度，故60“g蛋白所需要的体积数恒定，即每孔上样的体积相同。(3)电泳：以100V电泳约1rain，电泳至嗅酚蓝到达分离胶底部。4)蛋白质转膜：F膜甲醇中浸泡20到T．Glycine转移缓冲(15％甲)中平衡至少5n；．PAGE在—Glycine转移缓冲液平衡少30min；在冷却条件下以100v恒压转膜2hr。(5)转印膜封闭：转膜结束后，放到T-TBS(含5％脱脂奶)室温封闭1 hr，然后T-TBS漂洗，5minx3。(6)一抗杂交：一抗都以一定的比例溶于T-TBS(溶入3％脱脂奶粉)，4℃孵育过夜；T-TBS漂洗minx4；内参GAPDH以1：2000T-TBS中。本实验中一抗具体稀释倍数如下：anti．Glralantibody(MILLIPOREABl5012)f100)万方数据浙江大学硕士学位论文 正文实验方法(7)二抗杂交：二抗以1：5000溶于T-TBS(溶入2％脱脂奶粉)，室温摇床缓慢震荡hr，；然后T-TBS漂洗55；内参GAPDH同样；(8)信号检测：制备约lmlECL工作液，室温孵育转印膜lmin，然后去除多余ECL试剂，保鲜膜密封，采用SuperSignal⑧WestDuraExtendedDurationSubstrat仪器，暗盒中放raym曝光50in后进行显影和定影。(9)数据分析：采用QuantityOne4．6．2软件分析条带的光密度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白(光密度值)／内参GAPDH(光密度值)进行表示，结果以平均数士标准差表示。27统计学分析运用统计软SPSSl，进行onwaya检验，P<05为差异有显著性。万方数据浙江大学硕士学位论文 正文结果3结果3．1异(已表)3．2II对2代小鼠脑组织基因表的影响10IVM、VVM及各组F2代小鼠脑组织各基因表达分析10周时，与VVM及NC组小鼠相比(图4A)，IVMGlral表平显著降低(表达量为VVM组o．86倍，P<0．05；)。其中以单一父源性因素影响最显著(图4B)，MN组GlralIN组降低明显0．6倍，P<0．001)。而组代小鼠问其他相关基因表达水平的差异没有统计学意义。 (图4C)。图4一A图4。B23万方数据浙江大学硕士学位论文 正文结果图4．C图4ⅣM、VVM及NC各组小鼠脑组织神经活动配体．受体相互作用基因表达 舢10周各组F2代小鼠中除Glral外各基因表达未见明显差异。B)10周2代小鼠IVMGlral基因表达显著降低，差异具有统计学意义。 周F2代小鼠各小组间Glral基因荧光定量PCR分析结果。其中以N组与IN组之间表达差异最为显著，差异具有统计学意义。：术P<00：木木P<0： 串P<0524万方数据～㈨ 栅。一t篙浙～㈨ 栅。一t篙以下是各基real-timePC溶解曲线：b C。～v”玳x'～黔；t‘f～∞一，意 5d

搿蚺融’：”‘’3we fg图5F2代小鼠脑组织各基因real．timePCR的溶解曲a)GlralcDNA扩增的溶解曲线；b)Agtr2cDNA扩增的溶解曲线；c)Slpr5cDNA扩增的溶解曲线；d)Grid2cDNA扩增的溶解曲线；e)Gria4cDNA扩增的溶曲线；f)GalrlcDNA扩增的溶解曲线；g)GapdhcDNA扩增的溶解曲线。万方数据浙江大学硕士学位论文 正文结果33 IVM对脑组织Glral起始序列甲基化影响根据图表4B和图表4C显示，相比VVMF2代小鼠，IVM小鼠脑组织Glral基因表达降低明显。由此本研究选取Glral启动子序列区一个甲基化岛上的6个CpG位pG。6)进行甲基化情况分析。(1)10周各组F2代小鼠脑组织Glral的甲基化状态分析在0周IVM2代小鼠脑组织Gral的CpG2位点相比于C组提示甲基化水平升s4士1，差异具有统计学P<5。但VVM小鼠2代相比虽然甲基化水平升高，但差异无统计学意义。IVM小鼠脑组织Glral的CpG6位点甲基化率(4．25士1．17％)相比VVM组(3．62士O．9％)及NC组(3士1．15％)均有显著性升高，差异具有统计学意义(P<o．05)。而小鼠脑组织Glral其他CpG位点甲基化状态无统计学差异。(图6．6．A三大组(IVM、VVM、NC)10WF2代小鼠Glral基因的甲基化情况(图P1．6分别代表CpG位点1-6)木术木：P<0．001；木木：P<0．01；木：P<O．05(2)单一父源性因素对F2代Glral甲基化的影响分析对上述各组的甲基化情况进行父母源性影响的分析。