川贝母4种基源种的种内、种间化学成分比较

川贝母4种基源种的种内、种间化学成分比较

川贝母甜、苦、苦。具有清热、润肺、祛痰、止咳的功效。主要治疗肺热干旱、排泄粘液和胸闷。目前发现的贝母属植物有60种、45变种和5变型。2005年版《中国药典》收载的川贝母的4个基源种为百合科植物卷叶贝母FritillariacirrhosaD.Don、暗紫贝母FritillariaunibratataHsiaoetK.C.Hsia、甘肃贝母FritillariaprzewalskiiMaxim和梭砂贝母FritillariadelavayiFranch的干燥鳞茎。前三者按性状不同分别习称为松贝、青贝,后者为炉贝。松贝的植物种源主要为川贝母,品质最优;青贝的主要为暗紫贝母,品质亦优;炉贝的一般为梭砂贝母,品质次于松贝、青贝。川贝母中主要有效成分为生物碱,4个基源种川贝母的共有有效成分为贝母辛。文献采用双相滴定法测定了《中国药典》收载的4基源种17个不同产地的川贝母生物碱的含量,测得17个不同产地的川贝母中总生物碱的含量以卷叶贝母较高、暗紫贝母偏低。但川贝母的成分并不仅限于生物碱类,单以生物碱类成分判断其品质的优劣有失偏颇,因此,研究采集了主产区4个基源种的川贝母,采用氢核磁共振技术结合模式识别(1HNMR-PR)法对样品进行了比较研究,以此说明4种基源种川贝母样品间主要代谢物的差异,为更合理地使用川贝母提供参考。1实验部分1.1药物学系鉴定核磁用BrukerAVII-600MHz核磁共振仪测定。卷叶贝母FritillariacirrhosaD.Don、暗紫贝母FritillariaunibratataHsiaoetK.C.Hsia、甘肃贝母FritillariaprzewalskiiMaxim和梭砂贝母FritillariadelavayiFranch基源种均经鉴定,所有样品现均保存于四川大学华西药学院天然药物学系;甲醇为分析纯;数据分析软件为MestRe-C4.7、SIMCA-P11.0。1.2方法和结果1.2.1样品溶液的制备称取约1.2g研碎的川贝母样品(过80目筛),加入15mL甲醇,称重,于55℃水浴中回流90min,冷却后称重,并补足重量,过滤;弃去初滤液,取10mL续滤液,减压浓缩至干,真空干燥30min;残渣用0.5mLDMSO-d6溶解,转入5mm核磁管中,即得样品溶液。依法制得24份川贝母的样品溶液。1.2.2建立预饱和脉冲序列和数据矩阵将所有待测样品于296K恒温在核磁共振仪中,以DMSO-d6为内锁,每个图谱扫描64次,采样时间域为64k,谱宽为12.34kHz,采样时间为2.66s,脉冲间隔D1为3.00s,采用标准的预饱和脉冲序列(zgpr)压制水峰信号。获得各样品的自由衰减(FID)信号。将各样品的FID信号导入Mestre-C软件进行傅立叶转换,经修整基线、调整象限后,以DMSO-d6信号峰的化学位移值δ2.50为标准校正图谱。每张图谱的δ10.00～0.00化学位移区间,按每0.05化学位移值单位进行分段积分,即得到化学位移值段与积分值一一对应的数据矩阵(200×24)。该矩阵的行代表不同的化学位移段,列代表对应于化学位移值段的积分值。将该数据矩阵导入Excel软件,进行归一化处理后,获得新数据矩阵。将新数据矩阵导入SPSS或SIMCA-P软件,调用聚类分析或主成分分析程序,进行聚类分析或主成分分析。1.2.3各种川贝母间的图谱4种川贝母基源种样本的1HNMR图谱见图1。直观地比较这4张图谱均相似,很难发现彼此存在的明显差异。图谱仅是每种各1个样品的图谱,存在的细微差异可能源于样品本身或样品处理、测定过程中的差异,因此,以单张图谱并不能判断4种川贝母间存在的明显差异。为此,选用模式识别法中的层次聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)等方法从不同角度进行鉴别分析,并相互验证分析结果的可靠性。1.2.4树状分类分析HCA分析是一种根据数据间的相关性对分析对象进行分类分析的方法,属于模式识别中的非监督法。将4个基源种川贝母的24个样本的数据导入SPSS11.5软件,并做HCA分析,获得树状分类图(图2)。从图2可以看出:卷叶贝母6个样品(jy1-6)和甘肃贝母6个样品中的5个样品(gs2-6)相对集中,说明卷叶贝母和甘肃贝母各有特征;梭砂贝母6个样品中有4个样品(ss2、3、5、6)相对集中;而暗紫贝母6个样品中的3个样品(az1-3)与甘肃贝母相近,另3个样品(az4-6)则与卷叶贝母相近。说明暗紫贝母在整体成分上介于卷叶贝母和甘肃贝母之间。1.2.5各基源种川贝的得分散点分布将4个基源种川贝母的24个样品数据导入SIMCA-P软件,选择PCA分析。先从原始数据矩阵中提取主成分,前6个主成分的累计贡献率已达到85%以上,即表示前6个主成分能解释原变量信息的85%以上。以前6个主成分的得分值分别为横、纵坐标绘制得分散点图,并对各图中各样品得分散点的分布情况进行比较分析。结果显示:以主成分2(PC2)和主成分1(PC1)的得分值为横、纵坐标绘制的得分散点图(图3)对样品的区分效果相对更明显。表明4个基源种川贝的区别主要集中在PC1和PC2上。由图3的得分散点图可以看出:4个基源种川贝母的得分点集中在95%可信区间,彼此间的差异并不大。但仔细分析,4种贝母间也存在些微差异:暗紫贝母样品集中在t负值和t正值区,梭砂贝母的样品集中在t零值附近和t负值区,卷叶贝母的集中在t零值附近和t正值区,而甘肃贝母的集中在t正值附近和t零值附近区。其中卷叶贝母、暗紫贝母和梭砂贝母样品间的分散程度相对较大。1.2.6数据处理与分析为进一步了解不同基源种川贝母在成分上的细微差异,选取川贝母样品中卷叶贝母、暗紫贝母和梭砂贝母样品中各两个样品进行数据还原作图(XObs图)后再进行分析(图4)。图4中每两个同种川贝母样品间在整体图谱上的信号峰数量和形态无明显差异,但δ4.0～0.8信号峰的高低却有较大差异。据文献可知:川贝母的主要有效成分甾体类生物碱的1HNMR信号特征为δ4.15～0.79,因此,每两个同种川贝母样品间的差异主要体现在样品中主要成分的含量有差异。1.2.7特征峰位分布从图3已知不同基源种的川贝母样品间有一定差异,为了解这种差异具体体现在哪些化学成分上,作者任意选取4种基源中川贝母中的各1个样品,作XObs图(图5)。由图5可得:不同基源种的贝母样本在δ4.0～0.8变量范围内,不仅信号峰的强弱差异较明显,且峰型和峰位(化学位移值)也有差异。如甘肃贝母样品在化学位移δ1.06、1.78、2.52、3.14、3.18、3.42、3.64、3.56、3.58、3.78、3.88、3.90处的峰比其他3个基源种的都明显高很多;其中,δ1.06为贝母乙素的特征峰之一,因此,推测甘肃贝母中含贝母乙素的量可能比其他3个基源种贝母都高;梭砂贝母在对应位移的峰除δ0.86、1.24、1.45、2.18外,都比甘肃贝母低,但比暗紫贝母和卷叶贝母高;而暗紫贝母与卷叶贝母则差异较小。上述分析说明,不同基源种川贝母在所含化合物成分的种类和量上都存在一定差异。2川贝母样品点4种基源种川贝母样品点均相对集中在95%可信区间内,说明4种川贝母样品在整体成分上比较相近;即使在可信区间内,各川贝母样品点也相对分离,说明各