近交3个猪群体微卫星等位基因的遗传分析

近交3个猪群体微卫星等位基因的遗传分析

0保种和分子遗传研究[研究意义]猪是人类理想的动物模型。近交系猪基因高度纯合，便于实现人源化基因改造，最终成为人类异种器官移植理想的供体，在异种器官移植上有着独特的、重要的应用价值。【前人研究进展】国外在20世纪50-60年代开始了大规摸近交猪的培育，但至今尚未见成功报导。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所在20世纪80年代，将海南岛五指山小型猪同窝2头母猪和1头公猪引入北京，开始五指山小型猪（WuzhishanMiniaturepig,WZSP）异地保种，在一公一母基础上近交繁育了19世代，基本形成了一个近交群体，对其矮小性、与人类免疫学的相似性等方面开展了分子遗传学研究。【本研究切入点】目前还未对这一近交群体进行全面的分子遗传学研究，而最新的报道只研究到F17代，未明确揭示出五指山猪近交系的遗传规律。【拟解决的关键问题】本试验利用微卫星DNA标记，检测WZSP近交家系的遗传变异程度，揭示近交系猪微卫星基因座上等位基因的变化规律，探讨可能维持WZSP种质特性的等位基因以及遗传稳定性的分子遗传基础。1材料和方法1.1样品的制备和聚合酶的构建60份耳皮肤组织样本均采自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所五指山猪实验用近交系培育基地，在其3个家系5个世代的近交选育体系中，随机剪取60份个体的耳组织，其中F14代13个，F15代14个，F16代15个，F17代10个，F18代8个，全部样品用75%酒精处理后，于-20℃冰箱保存，备提DNA。10×PCRBuffer、dNTP和TaKaRaTaqDNA聚合酶均购自宝生物工程大连有限公司；遗传分析仪（ABI3130XL，日本）上样缓冲液去离子甲酰胺（Hi-Di）和分子量内标GeneScan-500LIZ购自ABI公司。1.2方法1.2.1保存：220参考文献，采用常规酚抽提法，将提取的DNA溶于TE中，-20℃保存。用琼脂糖胶电泳（DYY-4型北京）和核酸蛋白质分析仪（DU640，美国）双重检测DNA的纯度和浓度（图1），然后稀释到50ng·μl-1备用。1.2.2微卫星设计的选择和参数设计根据Barker1.2.3pcr扩增条件14对微卫星标记引物根据其扩增片段大小和标记荧光颜色分为5个组，每组片段大小和荧光颜色不发生重叠，同一颜色内不同引物彼此扩增的片段大小相差10bp以上。每一个基因座PCR扩增反应条件：95℃变性5min;94℃解链30s、52～60℃（详见表1）退火30s、72℃复性40s,40个循环，72℃延伸10min。PCR反应的总体积为15μl：引物F0.2μl，引物R0.2μl,dNTP0.3μl,Taq酶0.1μl,Mg2+0.9μl,ddH2O9.8μl，模板DNA2μl,10×PCRBuffer1.5μl。1.2.4abi测序仪将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带的强弱程度确定加入量，一般为0.3～1.0μl，上样缓冲液去离子甲酰胺（Hi-Di)7.75μl，分子量内标GeneScan-500LIZ0.25μl。具体步骤如下：根据样本量计算出所需上样缓冲液去离子甲酰胺（Hi-Di）和分子量内标GeneScan-500LIZ的总体积，量取后充分混合，根据每孔8μl的量分别添加到ABI测序仪专用96孔板加样孔中；根据已计算好的PCR产物的量，将PCR产物加到对应孔中；3000r/min离心瞬时，取出后95℃变性5min，立即冰浴5min；上样于遗传分析仪，运行DataCollection程序，开始电泳、收集荧光信号、形成胶图。1.3wzsp的基因组织利用GeneMapper软件对收集的原始数据进行分析，辅以人工校正，得到WZSP近交系的微卫星基因座等位基因片段的大小和基因型；根据个体的基因型数据来估算总群体、各家系和各世代的基因杂合度（H）、多态信息含量（PIC）和等位基因数目（N）。2结果与分析2.1基因型的鉴定荧光PCR产物电泳结果如图2。各电泳带表示WZSP近交系微卫星基因座的等位基因大小和基因型；第1条泳带表示SW205在47号个体的等位基因大小和基因型（等位基因片段大小为153bp，纯合型），第2条泳带表示SW2在9号个体的等位基因大小，基因型为纯合型，第3、4、5条泳带分别表示SW0070、SW936在第7、48号个体的基因型。结果表明，所选用的14个微卫星标记在3个家系中，共检测到29个等位基因，平均每个位点2.03个等位基因，其中SW2409、SW510、SW71位点在3个家系F16-F17中已经完全纯合。2.2平均杂合度变化情况WZSP近交家系Ⅰ3个世代的14个微卫星检测的结果见表2。F14、F15、F16代的平均等位基因数、平均杂合度分别为2.2、1.8、1.8和0.44、0.36、0.38，可以看出平均等位基因数随近交代的增加而减少，平均杂合度也呈现相同的变化趋势和规律。检测的14个微卫星位点中SW2409、SW71、SW510在3个世代都呈现完全纯合的状态，SW225、SW0070在F16也亦达到完全纯合。表明WZSP随近交代数的增加，其基因纯合的位点还会逐步增加，但发现有少数位点呈不规则的变化，如SW61和SW2在3个世代的杂合度分别为0.33、0.5、0.75和0.16、0.5、0.75，但它们的多态信息含量和等位基因数却变化不大，分别为0.34、0.37、0.37和0.36、0.37、0.34，等位基因数均为2个，提示这些杂合的基因有可能是WZSP生存所必需的或者是与本家系的特性有关。2.3wzsp近交群体的遗传多样性WZSP近交家系ⅡF15-F18的14个微卫星位点的检测结果见表3。F18个体14个被检位点中有7个位点达到完全纯和，分别是SW2、SW1377、SW0070、SW61、SW2409、SW71、SW510;F15-F18的平均杂合度和等位基因数分别为0.37、0.36、0.32、0.25和2.3、1.7、1.85、1.78，平均为1.92。表明随近交世代的推进平均等位基因数逐步减少，平均杂合度也呈明显的递减趋势；该家系平均杂合度为0.32低于WZSP近交群体平均杂合度0.42，表明该家系的基因纯合度较高。但SW1119、SW0036、SW874、SW205、SW902位点的平均杂合度却分别为0.47、0.53、0.50、0.74、0.62均明显高于该系和群体的平均杂合度0.32、0.42。这些位点在每个世代中总保持较高的杂合度，其杂合度变化也呈现无规律性。暗示这些高度杂合状态的等位基因可能是WZSP生存所必需的或者是与本家系具有的某一特性有关,也有待进一步研究来证实。2.4微卫星位点基因型WZSP近交家系ⅢF14-F17的14个微卫星位点的检测结果见表4。4个世代平均杂合度分别为0.42、0.46、0.39、0.48，平均杂合度为0.44，高于群体杂合度0.42，但平均等位基因数却只有2.17个。结果表明家系Ⅲ的等位基因纯合度随近交代数增加速度较之近交Ⅰ系、Ⅱ系提高程度缓慢，但平均多态信息含量也仅为0.30，在0.25和0.5之间属于中等多态信息。从微卫星位点基因纯合程度来看，F17已有SW2409、SW510、SW71等3个位点纯合，除SW0036、SW225外，其余9个位点杂合度均高于群体杂合度，但低于版纳小耳猪近交系的群体平均杂合度。家系Ⅲ从F14-F17随近交代数的推进，微卫星位点基因的纯合速度较家系Ⅰ、Ⅱ缓慢，造成这一现象的原因有待进一步研究。2.5个家系聚合度WZSP近交3个家系间平均世代基因杂合度和等位基因数比较结果见表5。3个家系间的分化系数已达到0.07，出现明显的分化趋势，各家系基因杂合度也有所不同，其中Ⅱ系杂合度最低为0.32，其次是Ⅰ系0.40，最后Ⅲ系为0.44。3个家系PIC和N分别为0.26、0.25、0.32和2.0、1.92、2.17，与H变化趋于一致。从分子遗传学的角度来讲，WZSP近交3个家系已有不同，各自成系。3讨论3.1保种基本遗传参数王昕等对海南五指山猪、滇南小耳猪、贵州香猪、广西巴马猪等4个小型猪225头进行了9个微卫星基因座分析，发现除S0003外其余8个微卫星基因座全部表现多态，H和PIC分别为0.5990～0.7165和0.5774～0.6871；牛荣等和商海涛等对3品系小型猪35个微卫星基因座的遗传学研究发现，除Sw973外，其余34个微卫星基因座全部表现多态；王希龙等研究发现海南省五指山猪国家级原种场五指山猪核心群和近交群的H、PIC和N分别为0.558、0.559,0.742、0.708和9.41、13.66；黄礼光等对海南省五指山猪国家级原种场近交选育至第3世代、5个重要家系内的150余头海南五指山猪进行了测定，所采用的32个微卫星基因座全部表现多态，总群体的H、PIC和N分别为0.559、0.731和13.66；欧江涛等对海南五指山猪核心群进行了分子遗传学检测，发现平均杂合度仅为0.56，平均等位基因数为9.4；王希龙等进一步采用30个微卫星基因座对与欧江涛研究有相同来源和世代的4个群体的114头五指山猪作了分析，发现几乎所有基因座均表现多态（仅有1个基因座在其中1个群体中呈单态），群体中的H、PIC及N分别介于0.520、0.507及4.533(12份样本）和0.549、0.691及8.300(54份样本）之间，这些参数与该品种的保种核心群基本一致，有关海南五指山猪等的H、PIC和N的数据均明显高于本试验结果。造成本试验结果与海南五指山猪遗传学参数差异的原因可能有2个：其一，目前海南五指山猪保种场种群，是来自海南省内不同地区的群体，保持其不同地区群体遗传的多态性；其二，与近交代数有关。本试验选用的五指山猪是由2头五指山猪经十几代近交培育出来的，近交程度远远高于普通的海南五指山猪，3个家系群体中14个基因座中分别已有3～7个纯合，而海南五指山猪30个基因座仅有1个纯合。等位基因数也证明了这点，五指山猪近交系每个基因座最多不能超过4，实际检测群体的平均等位基因数仅为2.02，远远低于海南五指山猪平均等位基因数9.4。此外，随着近交程度的增加，多态信息含量也随之降低，使3个近交家系较海南五指山猪大为降低（0.25～0.32对0.5～0.549）。本结果也说明五指山猪近交系群体经过多代近交培育，在分子遗传学上已有别于普通小型猪和海南五指山猪。张青峰等采用9个微卫星基因座对WZSP近交家系培育初期的14～16世代共50个体的遗传变异进行了初步分析，其中有2个基因座固定，总群体的H、PIC和N分别为0.3849、0.3270和2.11。本试验发现WZSP近交家系Ⅰ、Ⅱ在14世代时就已有3个基因座被固定下来，其中家系Ⅱ18世代已有7个基因座被固定下来，而且3个近交家系F14-F18平均每个位点仅有2.03个等位基因，家系ⅡF18的平均杂合度和等位基因数分别为0.25和1.78，到18世代时被固定下来的基因座高达50%（7/14），这些是中国目前所有小型猪近交群体或品系中较高的比例。因此，WZSP的3个近交家系已达到较高的近交水平，具有较高的纯合度和遗传稳定性。3.2wzsp近交系的遗传多样性本试验发现WZSP近交Ⅰ系3个世代平均杂合度0.4，平均等位基因数2，经过3代的近交培育之后，在14个被检位点中有3个位点的等位基因数由3变到2，有1个由2变到1，有3个位点一直处于1；表明微卫星等位基因的杂合度随近交代数增加而降低，等位基因数则逐步减少，在近交家系Ⅱ、Ⅲ的试验结果中也出现了类似的现象，这与李瑞生等对近交系小鼠的研究结果基本一致，但也有所不同，表现在有少数微卫星等位基因杂合度未能随着近交世代的增加而降低，反而呈现无规律的变化，使等位基因纯合程度未能达到近交鼠那样的纯合速度，F5近交小鼠等位基因纯合率能达到66.7%，F10等位基因的纯合率就高达96.7%，这可能与小鼠本身的种质特性、采用全同胞的近交方法、近交推进速度较快有关。WZSP近交系猪微卫星等位基因未能出现高的纯合率，可能与其具有多样性的种质特性有关，在近交不断纯合过程中，不但要淘汰有害基因、纯合优良基因，还要保持该品种某些多样性特征，有关此推论仍需进一步验证。本试验发现SW874、SW902、SW936位点等位基因杂合度未能随近交世代的增加而降低，反而呈现无规律变化，维持在0.5以上相对较高的水平，如WZSP家系Ⅱ的H和PIC在4个世代分别为0.37、0.36、0.32、0.25和0.3、0.25、0.26、0.18，呈明显下降趋势，但SW902的H和PIC在4个世代分别为0.60、0.60、0.60、0.67和0.52、0.34、0.32、0.56，家系Ⅰ也出现类似的现象，如SW902的H和PIC在3个世代分别为0.88、0.50、0.40和0.62、0.46、0.45，家系Ⅲ也有类似的现象，如SW902的H和PIC在4个世代分别0.60、0.86、0.67、0.67和0.52、0.60、0.56、0.56,H和PIC却只在一定范围内浮动，甚至到18世代时仍有近43%的基因座表现出较高水平的多态性，拥有2～4个等位基因，H介于0.59(Sw874）至0.60(Sw936）之间。这种现象完全不符合群体遗传学基本理论，在经历如此多世代的高度近交后，这些一直处于高度杂合状态的基因座应被视为WZSP近交系的种质特异性，而与这些基因座处于同一连锁群的某些功能基因在维持极高近交水平下WZSP的基本生存能力中可能起着关键作用