蚕豆病 生化设计实验

2011级临床四大班第四实验室1,2小组组员：杨从德（201101171）王永波（201101168）武桂芬（201101170）王小花（201101167）试验时间:第十八周生化设计实验(yangcongde@)一、根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？蚕豆病恶心、呕吐、面色苍白皮肤及巩膜黄染红细胞1.98×1012/L血红蛋白53g/L血清总胆红素85.5µmol/L尿蛋白（++）尿胆红素(－)尿胆素原(+)尿液镜下未见红细胞黄疸红细胞膜不完整，已破裂红细胞含量少含量明显增加血红蛋白量减少排尿呈酱油样色游离胆红素增加溶血性黄疸蚕豆病肠肝循环增多蚕豆病简介蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。易发人群多见于儿童，男性患者约占90%以上。二、设计实验2、设计实验进一步明确诊断。贫血、黄疸有和无遗传史无或有诱因（食用蚕豆、服用药物、感染）体征：脾肿大、黄疸血常规检查血清学检查检查HA的病因G6PD筛选试验G6PD确诊试验Hb↓、网织红细胞↑间接胆红素↑尿胆原↑游离Hb↑结合珠蛋白↓怀疑其他HA,相应病因检测结果正常G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定G6PD基因分析其他筛选试验高铁血红蛋白还原试验初诊或确诊G6PD缺陷症确诊溶贫（血管内溶血）确诊G6PD做1项或2项做1项高铁血红蛋白还原试验

G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定筛选试验→确诊试验实验原理一、高铁血红蛋白还原试验实验原理：在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术）亚铁血红蛋白高铁血红蛋白高铁血红蛋白还原酶

NADPH(辅酶)亚甲蓝(递氢体)实验反应方向主要试剂：0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液①、0.4mmol/L亚甲蓝溶液②、0.28mol/L葡萄糖溶液③、混合液（等量①+②+③）、生理盐水、抗凝剂仪器：紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支高铁血红单白还原实验实验流程取静脉血1.8mL于抗凝管，混匀抗凝管(含0.2mL109mmol/L抗凝剂+葡萄糖20mg)离心沉淀1000r/min15min调整血细胞∶血浆=1∶1，混匀→调整后全血（备用）1ml

0.18mol/L亚硝酸钠1ml0.28mol/L葡萄糖溶液混匀→混合试剂（备用）

1ml0.14mmol/L亚甲基蓝液高铁血红单白还原实验实验流程取试管3支,标上A、B、S,按下表加入试剂高铁血红蛋白还原试验操作步骤混合试剂/mL0.01//生理盐水/mL/0.01/0.18mol/L亚硝酸钠-//0.010.28mol/L葡萄糖溶液/mL经调整的全血/mL0.10.10.1来回摇动15～20次,置37℃水浴箱静置3h蒸馏水10.00ml10.00ml10.00ml试剂ABS高铁血红单白还原实验B管为空白管,在波长635nm处，测定“A”管及“S”管吸光度实验流程计算高铁血红蛋白还原率公式：MHb%=(1-A/S)×100%

高铁血红单白还原实验二、G6PD荧光斑点试验

实验原理：葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖（6PGA）,同时使NADP转变为NADPH,后者在340nm波长紫外线照射下产生荧光（反应原理如下图）。所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀后在0分钟、5分钟、10分钟分别取1滴血到滤纸上，通过观察滤纸上有荧光出现时间可判断G6PD活性NADPNADPHG6P

6PGAG6PD实验原理试剂：反应液：G-6-P液1份、NADP液1份、皂素2份、磷酸盐缓冲液3份和蒸馏水3份混匀仪器：长波紫外灯、滤纸、水浴箱G6PD荧光斑点试验实验流程G6PD荧光斑点试验取试管，加10μl全血+100μl反应液，混匀，取一滴于滤纸上（第一斑点）→作为对照将上液置于37℃水浴10min，再取一小滴滴于滤纸上（第二斑点）→实验组

晾干后，于长波紫外灯下（365nm）观察结果，计时根据结果作出相应诊断三、红细胞G6PD活性测定实验原理：基本原理同G6PD荧光斑点实验。不同的是利用紫外光分光光度法定量测定酶活性，即每隔一分钟在340nm波长测定孵育液中NADPH吸光度（测6次），求每分钟吸光度增加的平均值，根据单位时间内NADPH生成由于所用试剂及体系的不同。方法：①WHO推荐的Zinkham;②NBT定量法等实验原理试剂：生理盐水、溶血素、3.8mmol/LNADP、0.5mol/LTris缓冲液（pH7.5）、0.63mol/L氯化镁溶液、33mmol/LG-6-P液仪器：紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管实验流程取抗凝血2ml，生理盐水洗涤红细胞3次（1500r/min离心10min）除去上清液和乳白层（白细胞和血小板）加等体积生理盐水→红细胞悬液红细胞悬液0.05ml+溶血素0.5ml，混合，放置10min→

溶血液并测定其Hb浓度进行比色（见下表）红细胞G6PD活性测定G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法)试管对照管测定管NADP液（ml）0.10.1Tris液（ml）0.10.1氯化镁液（ml）0.10.1蒸馏水（ml）0.680.58G6P液（ml）—0.1

37℃预热溶血液（μl）2020红细胞G6PD活性测定立即340nm处测吸光度，以对照管调零，37℃恒温，每分钟观察1次，记录吸光度的变化实验流程计算公式：G-6-PD活性（U/gHb）=△A/min×1000/6.22×1020/20×Hb(gL-1)△A/min:每min吸光度的平均变化值1000/6.22:为微摩尔消光系数1020/20:总容量与溶血液的量之比；实验流程红细胞G6PD活性测定结果分析方法一、高铁血红蛋白还原试验：正常值：MHb还原率>=75%，脐血>=77%临床诊断：纯合子和半合子（XY）患者：MHb还原率<30%脐血<40%杂合子患者：MHb还原率<31%~74%脐血<41%~76%二、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验

正常人：0min斑点无荧光，5-10min出现，10min荧光最强临床诊断：轻度缺陷者：0-10min荧光很弱或不出现中度缺陷者：10-30min出现荧光严重缺陷者：30min内不出现荧光结果分析方法三、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定G6PD缺陷者：G6PD活性较正常平均值低40%以上即可作出诊断

方法正常值范围WHO推荐的Zinkham(12.01±2.09)IU/gHb(37℃)ICSH推荐的Glock与McLoan法（8.34±1.59）IU/gHb(37℃)NBT定量法（13.1~30.0）NBT单位Chapman和Dern法（2.8~7.31）IU/gHb(25℃)结果分析方法三、从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果★细胞膜的破坏★胆红素的异常

红细