微生物的实验室培养（30张）

一、培养基1、概念人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。2、培养基的类型①液体培养基②固体培养基注：（固体培养基需添加凝固剂，如琼脂；液体培养基不加凝固剂。）（工业生产）（微生物保存、分离、鉴定、活菌计数）课题1微生物的实验室培养思考：微生物“吃”什么？3、培养基的一般成分：水、碳源、氮源、无机盐等营养物质牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的培养基其他条件：A.生长因子：乳酸杆菌加维生素

B.pH值:霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性

C.氧气：厌氧微生物无氧条件（识记：乳液是维一安全的，也可喝点酸霉子汤）二、无菌技术：（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；（2）将培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。防止外来杂菌的入侵。1、消毒与灭菌（1）消毒①概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。在生物体的一定部位产生一种特殊的生殖细胞叫孢子。孢子的特点是能直接长成新个体。②常用方法:a、煮沸消毒法100℃煮沸5-6min，用于一般物品的消毒。b、巴氏消毒法70-75℃下煮30min或80℃下煮15min，对一些不耐高温的液体，如牛奶的消毒。c、化学药剂消毒酒精、氯气、石炭酸、煤酚皂溶液等，如酒精擦拭双手、氯气消毒水源等。d、紫外线消毒对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒。只适用于物体表面灭菌和空气灭菌。（2）灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。常用方法:a、灼烧灭菌用于金属用具（接种环、接种针）、或接种过程中试管口和瓶口的灭菌；b、干热灭菌160～170℃，1～2h。能耐高温的需要保持干燥的物品，用于玻璃器皿、金属用具的灭菌，所用设备是干热灭菌箱

；c、高压蒸汽灭菌121℃，100kPa，15-30分钟。用于培养基、无菌水等的灭菌，所用设备是高压蒸汽灭菌锅。1.计算：

2.称量：3.溶化：注：牛肉膏、蛋白胨易吸潮，称取时动作要快迅速、加盖。牛肉膏、称量纸、少量水加入烧杯→加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→搅拌溶解→→琼脂→搅拌熔化→调pH并补水至100mL牛肉膏黏稠，保证粘附在称量纸上的牛肉膏也溶于水中，减少误差作为凝固剂防止琼脂糊底而导致烧杯破裂依配方计算100mL培养基所需各成分的用量玻棒挑取牛肉膏于称量纸上称取。三、实验操作(以培养大肠杆菌为例)（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：最常用的细菌培养基4、灭菌①培养基：高压蒸汽灭菌②培养皿：干热灭菌思考1.在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞；取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌污染的作用。2.培养皿能否用高压蒸汽灭菌？不能,因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌。3.在培养微生物时，由于不同微生物适应的PH不同，因此在熔化后必须调节PH，那么是先调PH还是先灭菌?先调PH，后灭菌。

培养基装入锥形瓶，加棉塞，包牛皮纸扎紧，高压蒸汽灭菌；培养皿5～8套作一包，放于干热灭菌箱内灭菌。5.倒平板：培养基冷却至约50℃左右时6.无菌检查：

防止污染和挥发灭菌时避免水蒸气浸湿棉塞，取出培养基时，也起到隔绝空气中杂菌的作用4.灭菌：

37℃倒置培养24～48h，观察是否有微生物生长。用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时即可开始倒平板。灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。思考1.培养基灭菌后要冷却到50℃时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染,又可以避免培养基中的水分过快地挥发。空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。（1）平板划线法

通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。（二）纯化大肠杆菌1.将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环_______2.在_____旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞3.将试管口通过火焰4.将已______的接种环伸入菌液中沾取一环菌液6.左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划__________条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。5.将试管口通过火焰，并塞上棉塞火焰冷却三至五7.灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的_______开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。末端烧红8.将平板_____放入培养箱中培养。

倒置微生物的恒温培养将培养皿______（盖在下），放于_____℃恒温培养箱中培养__________小时。１２～２４倒置３７平板划线法获取的微生物经恒温培养后的生长情况1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？操作结束后灼烧：杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境及感染操作者。思考第一步灼烧：消灭接种环上的微生物避免污染培养物；每次划线前灼烧：为了杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到由单个细菌繁殖的菌落。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。(2)稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释后，分别涂布到固体培养基表面。稀释度足够高时，能培养出单个菌落。稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。涂布器系列稀释操作101102103104105106注意：1.移液管需要经过灭菌2.操作时，试管口和移液管应在离火焰1~2CM处将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中

取少量菌液（不要超过0.1ml）滴加到培养基表面

灼烧

待酒精燃尽后冷却8～10s

涂布将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液涂布均匀涂布平板：稀释涂布平板法的要点1、用移液管吸取菌液之前先摇匀3、所有操作都应在火焰附近进行2、涂布器从酒精中取出后，要在火焰上将其上的酒精烧掉思考

将接种后和未接种（作为对照组）的培养基均放到370C的恒温箱中，培养12～24h后进行观察并记录结果。涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？答：应从操作的各个环节保证“无菌”。1.酒精灯与培养皿的距离要合适；2.吸管头不要接触任何其他物体；3.要在火焰周围迅速操作。未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。三、结果分析与评价1、未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？2、在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。3、培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？4、如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。将菌种接种到试管的固体斜面培养基，放入4℃冰箱中保存。以后每3~6个月，要将菌种转移到新的培养基。四、课题延伸3ml甘油瓶中装入1ml甘油后灭菌，再加入1ml菌液，混匀后放入-20℃冷冻箱保存。1.对于频繁使用的菌种2.对于需要长期保存的菌种临时保藏：甘油管藏：例2：下列有关细菌培养的叙述，正确的是（）A．在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌B．在培养基中加入青霉素可抑制真菌而促进细菌生长C．向液体培养基中通人氧气能促进破伤风杆菌的生长D．在半固体培养基中接种细菌培养后可以观察其运动D例3：某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题。

(1)培养基中含有蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了___________和__________。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是__________和_____________。

(2)对培养基进行灭菌，应该采用的方法是_______________。

(3)为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于__________中培养，培养的温度设定在37℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种_________作为对照实验。氮源碳源

无机盐水高压蒸汽灭菌恒温培养箱无菌水(4)培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有___________种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越_____________。

(5)如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐____________细菌，这种培养基被称为__________。多高盐(或NaCl)

选择培养基例4：氯苯化合物是重要的有机化工原料，因其不易降解，会污染环境。某研究小组依照下列实验方案(如图1)筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。培养基配方如下表。(1)配制Ⅱ号固体培养基时，除添加Ⅱ号液体培养基成分外，还应添加______。

(2)培养基配制时，灭菌与调pH的先后顺序是_______________。琼脂先调pH、后灭菌(3)从用途上来说，Ⅰ号培养基和Ⅱ