动物病原学实验(动药专业)

动物病原学实验潘子豪进入实验室的注意事项1穿工作服2书本等物品放入抽屉3树立无菌概念4不能抽烟、吃零食5爱护公物，注意节约实验一显微镜的构造和使用

及细菌形态结构的观察一、目的要求：1、了解显微镜的简单构造原理2、学习掌握油镜的使用技术3、观察细菌的基本形态二、实验材料：普通光学显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、标本玻片:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌三、普通光学显微镜的基本结构四、几种显微镜的简单原理1、暗视野2、相差3、荧光4、电子五、油镜的识别及使用和原理六、使用完毕显微镜及标本片的处理七、作业：1、普通显微镜与油镜使用上有何区别？2、绘出你所观察到的细菌形态。普通光学显微镜的简单原理可见光紫外光电子衍射

分为光学显微镜和电子显微镜。光学显微镜又分为单式和复式。使用前侧面注视，调节粗焦轮（物镜距玻片5mm）；双目注视时，反时针调节粗焦轮，可见模糊镜像，顺时针调节细焦轮；每旋转一周粗焦，镜筒升降10mm，细焦0.002mm，先低倍后高倍；低倍使用时下降聚光器，高倍使用时上升聚光器。光线充足使用平面镜，光源不足使用凹面镜；使用高倍前先使用低倍选择目标视野，转移镜头换高倍，重新调节亮度。更换玻片时，重新低倍开始；使用完毕后，仔细擦拭，一切归位。四、油镜的识别及使用原理1光圈调最大2标本上滴加香柏油0.5-1滴3转换油镜头浸入油滴中五、使用完毕显微镜及标本片的处理油镜用过后，应立即用擦镜纸将镜头和玻片擦拭干净如油渍已干，须用擦镜纸蘸少许二甲苯溶液拭去油渍，再用干擦镜纸拭净镜头作业1。普通显微镜与油镜使用上有何区别？2。绘出你所观察到的细菌形态变形杆菌鞭毛特殊染色枯草杆菌，革兰氏染色枯草杆菌，芽胞简易染色葡萄球菌，革兰氏染色大肠杆菌，革兰氏染色破伤风梭菌，芽胞染色实验二细菌抹片的制备方法、染色及显微镜观察

实验二细菌抹片的制备方法、染色及显微镜观察

一、

目的要求：a)

掌握细菌抹片的制备方法b)

掌握几种常用的染色方法和技术及无菌操作技术c)

巩固显微镜的使用，并了解细菌的染色特性、形态二、

材料：炭疽杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌斜面，大肠杆菌肉汤三、

制片及染色步骤：取干净玻片→抹片→干燥→固定→染色→干燥镜检四、

常用的几种染色方法1、

革兰氏染色法（1）

草酸铵结晶紫染液1-2分钟，水洗（2）

革兰氏碘液媒染1-3分钟，水洗（3）

95%酒精脱色30秒-1分钟，水洗（4）

沙黄水溶液复染10-30秒，水洗（5）

吸干，镜检2、

姬姆萨染色法（1）

甲醇固定3分钟，时间长短均可（2）

姬姆萨液足量30分钟或数小时至24小时，水洗（3）

吸干，镜检3、

瑞氏染色法抹片干燥无需固定，直接滴加染液1－3分钟，再加等量中性蒸馏水，轻轻混匀，续染15分钟水洗，吸干镜检4、

美兰染色法：甲醇固定3分钟，加上足量染液2－3分钟，水洗，吸干镜检五、作业：1、根据实验体会，你认为制备染色标本时应该注意哪些事项？2、在你所做的革兰氏染色片中，大肠杆菌和炭疽杆菌各染成何色？它们是革兰阳性菌还是革兰阴性菌？3、作革兰氏染色时，涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败关键一步是什么？

一、目的要求1。掌握细菌抹片的制备方法2。掌握几种常用的染色方法和技术及无菌操作技术3。巩固显微镜的使用，了解细菌的染色特性、形态二、材料1、大肠杆菌：斜面、肉汤金黄色葡萄球菌：斜面炭疽杆菌：斜面2、革兰染色液、美兰染色液3、载玻片、接种棒、酒精灯等三、制片及染色步骤取干净玻片-抹片-干燥-固定-染色-干燥镜检

1、玻片的处理：旧玻片有油，用95%酒精擦洗，然后在酒精灯上灼烧

2、细菌抹片的制备：抹片根据所用材料不同，抹片的方法也有差异。（1）固体培养物用经酒精灯火焰烧过的接种环，蘸取生理盐水1-2环于清洁无油脂的载玻片中央，再勾取细菌的固体培养物少许混于生理盐水中，涂抹成直径为1-1.5cm大小的均匀的抹片。（2）液体培养物可直接用灭菌接种环勾取细菌培养物1-2环，涂抹于玻片上即可。但要注意将管底沉淀物摇匀，以免影响涂片效果。（3）组织涂片用灭菌的剪刀、镊子取被检组织一小块，以其断面在玻片上压印或涂抹成适当大小的薄片。如为脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上。（4）无论何种方法切忌涂片太厚，否则不利于染色和观察。

3、固定（1）目的:1)、除去抹片上的水分，使菌体蛋白附着在载玻片上，以防染色过程中被水冲掉。2)、使抹片易于着色，变性的蛋白质着色力强。3)、能杀死抹片中的部分微生物。（2）方法：1)、火焰固定将已干燥的抹片菌膜向上，以钟摆速度在酒精灯火焰上通过数次（以不烫手背为宜）。2)、化学固定加数滴甲醇于玻片上，固定2-3分钟，自然四、常用的几种染色方法1、革兰氏染色法2、姬姆萨染色法3、瑞氏染色法4、美兰染色法（一）革兰氏染色法1。草酸铵结晶紫染色1-2’，水洗2。革兰氏碘液媒染1-2’，水洗3。95%酒精脱色约30’’-1’，水洗4。沙黄水溶液复染10’’-30’’，水洗5。吸干，镜检（二）姬姆萨染色法1。甲醇固定3’，时间长短均可2。姬姆萨液足量30’或数小时至24h，水洗3。吸干镜检（三）瑞氏染色法抹片干燥无需固定，直接滴加染色液1-3’，再加等量中性蒸馏水，轻轻混匀，续染15’，水洗，吸干镜检（四）美兰染色法1。固定好抹片加上足量染液2-3’2。吸干镜检注意事项1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开2、涂片不宜太厚，涂布时宜轻不宜重3、保持无菌操作，试管开塞回塞前，管口消毒4、接种棒使用前后一定要在火焰上彻底灼烧灭菌，挑菌前待接种棒冷却后才用作业1。根据实验体会，你认为制备染色标本时应注意哪些事项？2。在你所做的革兰氏染色片中，大肠杆菌和炭疽杆菌各染成何色？它们是革兰阳性还是阴性菌？3。作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败关键一步是什么？返回实验三、培养基的制备

实验三、培养基的制备

一、

目的要求：1、掌握基础培养基制备的原则和要求;2、掌握一般培养基的制备过程及PH的测定二、

实验材料:（略）三、

操作方法：1、普通肉汤的制备：按量称取→加热溶解→调PH→过滤→分装→灭菌→菌检分别称取牛肉膏5g蛋白胨10g

NaCl5g磷酸氢二钾1g蒸馏水1000ml置铝锅内加热溶解，取5ml肉汤于试管内，用0.1NNaOH校PH至7.4-7.6，并根据其用量计算所配培养基需用的1NNaOH量，调PH，测好PH后，取500ml肉汤至量筒，余下的倒入大烧杯用滤纸过滤，分装10根短试管，余下的装入盐水瓶。2、普通琼脂培养基的制备：称取琼脂→肉汤内溶化→分装试管→灭菌→菌检将量筒内的500ml肉汤倒入铝锅，加入10g琼脂条，加热溶解，加热中搅动，用纱布棉花过滤，分装长试管10管，余下装入盐水瓶。

以上培养基分装完毕，捆扎好，每组做标记。3、将分装好的培养基扎口后高压灭菌（121℃，20-30分钟）。4、菌检四、作业：1、

制作培养基时应注意哪几点？为什么高压灭菌前需调PH稍高些？2、测较少量肉汤培养基的酸碱度至PH7.6时，采用0.1NNaOH溶液，而将全部肉汤培养基调至PH7.6时，却改用1NNaOH溶液，为什么？3、普通肉汤与普通琼脂培养基各有什么用途？一目的要求1、掌握基础培养基制备的原则和要求2、掌握一般培养基的制备过程及PH的测定二培养基的种类及用途1、固体培养基：分离培养、纯培养、保存菌种2、半固体培养基：细菌运动3、液体培养基：观察细菌的生长状况、保存菌种三、培养基制作的注意事项1、细菌生长所需的营养物质2、盛器均需无菌，不含抑菌物3、必须符合生长要求PH4、要过滤，应为半透明或透明5、制好后需高压灭菌四、培养基制备的一般过程按量称取→溶解→调PH→过滤→分装→灭菌→菌检五、PH测定方法1、以空试管取5ml溶解的肉汤，用1ml滴管吸0.1NNaOH，滴定，边滴边测PH，PH7.6时，计量NaOH用量。算出实际用量。2、改用1NNaOH调PH7.6。基础培养基制备1、配方：牛肉膏5克蛋白胨10克NaCL5克磷酸氢二钾1克蒸馏水1000ml2、按量称取→溶解→调PH→过滤→分装10根短管→灭菌→菌检琼脂培养基的制备测好PH后，取500ml肉汤至量筒，余下的倒入大烧杯，把量出的500ml再倒入锅中，称量10g琼脂，边加热边搅动，看一下水位，补足水分。琼脂完全溶解后以棉花沙布过滤，分装10根长管。

返回★作业1、制作培养基时应注意哪几点？为什么高压灭菌前需调PH稍高些？2、测较少量肉汤培养基的酸碱度至PH7.6时，采用0.1NNaOH溶液，而将全部肉汤培养基调至PH7.6时，却改用1NNaOH溶液，为什么？3、普通肉汤与普通琼脂培养基各有什么用途？实验四细菌的分离培养及移植

一、目的要求1、掌握细菌分离培养的基本要领和常用方法2、使被检材料适当稀释，以求获得独立单在菌落二、实验材料1、培养基：普通琼脂平板每人2块普通琼脂斜面、普通肉汤每人各1支2、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面、大金混合肉汤、感染大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的小白鼠3、酒精灯、接种棒、剪刀、镊子、记号笔三、需氧分离培养方法：1、平板分离培养法：平板划线法、倾注培养法（不常用）2、芽胞需氧分离培养法：80℃15－20分钟杀死不耐热细菌3、化学药品分离培养法4、实验动物分离培养法四、实验内容：1、平板划线法（组织→平板）、（金+大）肉汤→平板，每人二块2、肉汤培养（斜面→肉汤），每人一支，（大）斜面→肉汤3、斜面移植（斜面→斜面），每人一支，（金）斜面→斜面接种完标明细菌、日期、自己的记号，置37℃，恒温箱培养24小时（平板倒置），第二天抽时间看培养结果。五、作业1、何谓纯培养？分离纯培养的目的何在？2、在挑取固体培养物上的细菌作平板划线时，为什么每次都要将接种环上剩余的细菌烧掉？3、为什么要把培养皿倒置培养？1、平板划线法（组织→平板）、（金+大）肉汤→平板，每人二块2、肉汤培养（斜面→肉汤），每人一支，（大）斜面→肉汤3、斜面移植（斜面→斜面），每人一支，（金）斜面→斜面一、目的要求1、掌握细菌分离培养的基本要领和常用方法2、使被检材料适当稀释，以求获得独立单在菌落实验材料菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面大肠杆菌金黄色葡萄球菌混合肉汤实验动物：感染了大肠杆菌金黄色葡萄球菌的小白鼠培养基：普通琼脂平板、斜面、二、需氧分离培养方法

1、平板划线分离培养法：平板划线法、倾注培养法（不常用）2、芽胞需氧分离培养法：80℃15－20分钟杀死不耐热细菌，再接种至平板3、化学药品分离培养法：抑菌作用

杀菌作用鉴别作用4、实验动物分离培养法：本种动物或小鼠三、实验内容1、平板划线法（金黄色葡萄球菌+大肠杆菌肉汤→平板），每人一块，小鼠肝脏→平板，每人一块2、肉汤培养（斜面→肉汤），每人一支，大肠杆菌斜面→肉汤3、斜面移植（斜面→斜面），每人一支，金黄色葡萄球菌斜面→斜面标记接种完毕标明细菌、日期、自己的记号，试管置37℃，恒温箱培养24小时（平板倒置），第二天下午抽时间看培养结果。作业1、何谓纯培养？分离纯培养的目的何在？2、在挑取固体培养物上的细菌作平板划线时，为什么每次都要将接种环上剩余的细菌烧掉？3、为什么要把培养皿倒置培养？实验五细菌的生化试验

一、

目的要求：1、了解细菌生化试验在细菌学诊断上的重要意义2、掌握几种生化试验的方法二、实验材料大肠杆菌产气杆菌变形杆菌兔沙门氏菌微量发酵管试剂等三实验内容及操作1、糖或醇发酵试验2、

靛基质（吲哚）试验：将细菌接种于蛋白胨水的试管中→置温箱中，37℃培养24-48h→取出试管→加乙醚1ml，振荡→沿壁加4－5滴对二甲基氨基苯甲醛，观察结果。3、

甲基红（M－R）试验：将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水的试管中→置温箱中，37℃培养24-48h→取出试管→加甲基红4－5滴，摇匀。4、V－P试验：将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水的试管中→置温箱中，37℃培养24-48h→取出试管→加V－P甲液0.6ml摇匀→加V－P乙液0.2ml，5min之内看结果。5、枸椽酸盐利用实验6、硫化氢实验7、尿素实验8、细菌运动试验四作业：1、生化反应记录表2、解说你所做的生化反应各种原理3、以上生化反应试验哪几个是分解糖？哪几种是分解蛋白质？

糖发酵试验原理多糖－→单糖－→丙酮酸－→酸性产物(或产