肾气丸治疗脾肾阳虚型胃溃疡的机制及靶点研究

肾气丸治疗脾肾阳虚型胃溃疡的机制及靶点研究

慢性溃疡是指由胃消化液引起的胃肠粘膜损伤，形成粘膜下层的粘膜损伤。可发生在食管、胃、十二指肠、胃空肠吻合口和胃粘膜休息场所。临床上，溃疡（gu）和十二指肠溃疡（du）是常见的。本研究拟通过实验复制脾肾阳虚型GU动物模型,研究肾气丸治疗GU的作用机制及靶点,多角度评价肾气丸对GU模型的疗效。1材料表面1.1实验动物1.2微生物试剂盒金匮肾气丸由北京同仁堂生产;手参购自四川成都普度堂藏药销售公司;雷尼替丁由广东环球制药有限公司生产;15%大黄粉悬液由广州中医药大学脾胃所提供;100%冰醋酸由广东省光华化学厂有限公司提供;表皮生长因子(EGF)试剂盒由北京北方生物技术研究所提供;胃泌素(GAS)试剂盒由解放军总医院放免所提供。1.3光学显微镜、leicam2135切片机低速离心机LD5-2A型,北京医用离心机厂生产;光学显微镜,Olympus公司生产;LeicaRM2135切片机,德国Leica公司生产;SN-695B型放免测量仪,上海13环仪器一厂生产。2方法2.1动物模型2.1.1体重测定和血压15%大黄粉悬液灌胃,用药量8.9g/(kg·d),连服9天,每天记录体重。有萎靡、倦卧、毛枯槁、畏寒、消瘦、四肢不收、便溏脱肛、纳呆、活动频度下降、肛门红肿等表现者为造模成功,随机分入各实验组,进行下列实验。2.1.2胃轻质液消毒组脾肾阳虚大鼠禁食不禁水24h后,3%戊巴比妥钠1mL/kg腹腔注射麻醉,无菌操作,自剑突正中向下沿腹中线剪约2cm开口,轻轻拉出胃体,将直径5mm、长30mm的玻管垂直放于胃前壁窦体交界浆膜面上,向管内加入100%冰醋酸0.1mL,接触1min后用棉签吸干,生理盐水冲洗后,将胃轻轻送回,并以大网膜包裹,逐层缝合腹膜、腹壁肌层及皮肤,再次消毒。术后正常饲养。2.2肾体模型组成模大鼠40只随机分为模型组、雷尼替丁组、肾气丸组、肾气丸加手参组各10只。肾气丸组:肾气丸溶解于生理盐水中配制成浓度1.55mg/mL,每次10mL/kg灌胃,每天1次。肾气丸加手参组:肾气丸取上述浓度,手参研碎加生理盐水制成3.1mg/mL混悬液,两者相混摇匀,每次10mL/kg灌胃,每天1次。雷尼替丁组:研碎加生理盐水制成3.1mg/mL混悬液,每次10mL/kg灌胃,每天1次。模型组:造模后普食饲养,不进行治疗。14天后进行各项指标检测。2.3样品的采集和检测2.3.1麻醉前注射麻醉末次给药2h后,3%戊巴比妥钠1mL/kg腹腔注射麻醉(术前禁食不禁水24h)。眼球取血冻存于-80℃,待全部动物实验完毕后一起用放射免疫法测EGF、GAS。2.3.2胃壁结合特征组化取血完毕后,颈椎脱臼处死各组大鼠,剖腹取胃,结扎幽门、贲门,收集全部胃液,摘出整个胃,取少量胃壁组织用于测定胃壁结合黏液含量,其余部分置于1%甲醛溶液中固定10min。沿胃大弯剪开,冲洗后展开平铺,观察GU情况,并用游标卡尺测量出溃疡的最大长径和垂直于长径的最大短径,将两者的乘积作为溃疡面积指数。2.3.3胃蛋白酶活性测定中和法测定胃液总酸度(pH值):将上述收集的胃液2000r/min离心15min,各取上清液1mL,以酚酞为指示剂,用0.1mol/L氢氧化钠滴定到出现酚酞色所耗氢氧化钠的量×10即为胃液总酸度。改良Mett法测定胃蛋白酶活性:取内径为2mm的毛细玻璃管截成10cm长。洗净烘干,取适量的鸡蛋清,充分搅匀后用二层纱布过滤。将毛细玻璃管利用虹吸作用灌满蛋清(内无气泡)后,置85℃恒温水浴中使蛋清凝固,制成蛋白管。冷却后,用石蜡将毛细管两端封固,置冰箱中备用。取上述每只大鼠胃液上清液1mL,加入0.05mol/L盐酸15mL摇匀。每瓶中放入长约2cm的蛋白毛细管2根,塞好瓶口,于37℃的恒温箱放置24h后,取出毛细管,用游标卡尺测量毛细管两端的透明长度,求4个端透明长度平均值,计算胃蛋白酶活性。胃蛋白酶活性(kU/L)=平均值2×16。2.3.4ab-pas组化染色取少量胃壁组织,中性甲醛固定,脱水,常规石蜡包埋,制备5μm厚连续切片,用于AB-PAS组化染色。结果判定:酸性黏液物质呈蓝色,中性物质呈红色,中性和酸性混合物呈紫色。运用计算机图像分析测量再生黏膜总面积中PAS阳性面积的百分数(胃黏膜表面上皮细胞分泌中性黏液而被染成红色,故呈PAS阳性)。2.4统计方法3结果3.1浆膜层偶见炎性浸渍模型组:造模处黏膜缺损,偶及肌层,胃底腺轻度不典型性增生,再生腺细胞排列不整齐,黏膜下层炎性细胞浸润,并可见瘢痕纤维生成,部分小动脉血管内皮肿胀、增生,可见血栓或炎性栓塞;非造模处炎性细胞浸润;浆膜层有少量炎性细胞浸润,部分标本有缺损。雷尼替丁组:造模处可见被新生的胃上皮细胞和腺细胞覆盖,黏膜全层均有炎性浸润,但较模型组和对照组少,胃底腺轻度不典型性增生,黏膜下层有部分小动脉血管内皮肿胀、增生,可见少量血栓,浆膜层偶见炎性浸润。肾气丸组:与雷尼替丁组差别不大,黏膜愈合情况相对较好,腺体细胞增生数量较多,黏膜下血管未见明显病理改变,但炎性细胞浸润仍可见。肾气丸加手参组:黏膜表面基本完整,胃上皮细胞与腺细胞形态及分布良好,腺体细胞增生数量较多,轻度不典型性增生,黏膜下层仅见少量炎性细胞浸润,黏膜下微循环未见明显病理改变,浆膜层完整,仅少量炎性细胞浸润。3.2两组溃疡面积,以肾丸加手参组1例见表1。雷尼替丁组、肾气丸组、肾气丸加手参组溃疡面积与模型组比较明显缩小,差异有显著性或非常显著性意义(P<0.05,P<0.01),且以肾气丸加手参组溃疡面积最小。雷尼替丁组、肾气丸组、肾气丸加手参组PAS阳性面积大于模型组,差异有显著性或非常显著性意义(P<0.05,P<0.01)。3.3两组ph值、胃蛋白酶活性的比较见表2。雷尼替丁组、肾气丸组、肾气丸加手参组pH值、胃蛋白酶活性较模型组下降,差异有显著性或非常显著性意义(P<0.05,P<0.01)。3.4差异显著性p>0.0.0见表3。肾气丸加手参组EGF水平较模型组降低,差异有非常显著性意义(P<0.01)。肾气丸组、肾气丸加手参组GAS水平较模型组升高,差异均有显著性意义(P<0.05)。4对大鼠胃黏膜的影响GU的病因病机复杂,目前尚未完全阐明,一般认为主要与胃黏膜的防御因子与攻击因子失衡有关。近年来,随着H2受体拮抗剂和质子泵抑制剂相继应用于临床,GU的近期愈合率得到明显提高,但这些药物的副作用及停药后GU的复发仍是急待解决的问题。而传统中医中药则在增强胃黏膜防御能力、提高GU愈合质量、减少复发等方面逐步发挥出了优势。肾气丸来源于东汉·张仲景所著《金匮要略》,因本方由8味药组成,故又名八味丸,本方构思奇特,配伍严谨,方中六味滋阴,具有“壮水之主以制阳光”的作用,桂、附温阳,具有“益火之源以消阴翳”的作用,相反相成,其意不在补火,而在微微生火,即生肾气,故名肾气丸。手参,兰科多年生草本植物,又名“阴阳草”,现代研究表明,手参的全草含挥发油6%,其中含甲基香荚兰醛和向日葵素。块根中含黏液质50%,淀粉27%,蛋白质3%,糖5%,其它尚含草酸钙、无机盐。GU的愈合是一个非常复杂的生理过程,包括细胞移行分化增殖和细胞外基质形成及新生血管生成等。胃酸分泌过多时,易破坏愈合环境,引起复发;另一方面,胃蛋白酶的最适合pH为1.8~3.5,乳蛋白经胃内少量胃蛋白酶作用就可以被消化。当泌酸不足时,会影响蛋白质的消化与吸收;同时随食物进入胃内的细菌也容易在体内生长和繁殖。本实验中,模型组pH值显著高于用药组,这是由于模型组大鼠胃黏膜受到了严重的破坏,导致泌酸功能乏力;而各用药组经治疗后,溃疡愈合,胃黏膜被修复,泌酸功能逐渐恢复。这也与溃疡面积数据吻合:雷尼替丁组、肾气丸组、肾气丸加手参组溃疡面积均小于模型组(P<0.05,P<0.01),其中以肾气丸加手参组效果最好。胃黏膜病理组织镜下观察结果也与上述结论相符,尤以肾气丸加手参组效果最好。本实验中,肾气丸组、肾气丸加手参组与雷尼替丁组一样能改变受试大鼠胃液酸度和胃蛋白酶的活性,说明它们与H2受体阻断剂一样能抑制胃酸分泌、减弱攻击因子的作用。肾气丸组、肾气丸加手参组可显著增加胃壁结合黏液的含量。而黏液具有保护胃黏膜免受腔内胃酸、胃蛋白酶、微生物和毒物等损害的功能,它与碳酸氢盐一起构成的黏液-碳酸氢盐屏障是胃黏膜的第一道防线。因此,实验提示肾气丸组、肾气丸加手参组对GU的防治作用,可能与其对中枢神经和自主神经功能的调节作用也有关,并且可能与增强胃黏膜的防御能力有关。EGF是一种具有广泛生物学效应的由唾液腺和十二指肠Brunner腺分泌的单链多肽,能够降低胃黏膜损伤程度,促进组织损伤修复[4~5]。有研究认为,在正常情况下,胃肠黏膜的完整性较好,所以血中EGF水平较低。而当胃肠黏膜存在炎症和溃疡时,受损的胃肠黏膜通透性增加,加之此时胃腔内EGF增加,便有较多的EGF进入血液循环。而本实验结果显示:经肾气丸加手参治疗的组别,血清EGF含量较模型组下降(P<0.01),表明肾气丸加手参能改善溃疡愈合的条件,促进胃黏膜的修复,从而使血清的EGF含量维持在正常的水平。GAS是与GU密切相关的胃肠肽类激素之一,它具有强大的刺激胃酸分泌效应。有实验证明,GAS起着刺激循环激素和神经递质的双