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细胞生物学综合性实验课程名称:细胞生物学实验姓名:班级:学号:时间:年月日植物原生质体的分离、纯化及融合1材料、试剂与方法1.1材料菠菜叶片,唐古特白刺愈伤组织,金盏菊花瓣。1.2试剂5%次氯酸钠,无菌水,酶液A,0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液,20%蔗糖溶液，0.16mol/L的Cacl2.2H2O溶液，酶液B,12%蔗糖溶液，PEG溶液，高PH高钙稀释液。1.3方法1.3.1称取金盏菊花瓣1.5g或菠菜叶1g,用自来水冲洗;分别用5%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，再用无菌水洗4次。1.3.21.将消毒后的金盏菊花瓣用镊子撕成细丝。2.酶解：加5ml酶液A,封口，保持28℃3.过滤及离心：600r/min离心5min,弃去上清液保留沉淀。1.3.1.将沉淀用2ml0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮。2.用注射器缓缓向离心管底部6ml20%蔗糖溶液,600r/min离心5min,得到原生质带。3.用注射器吸出管底杂质和蔗糖及上部Cacl2.2H2O溶液。4.留下的原生质带用5ml0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮,600r/min离心5min。5.用3ml0.16mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮。1.3.1.将菠菜叶和金盏菊的原生质体悬液等量混合。2.用吸管将混合的原生质体混合液滴在培养皿中，7-8滴每皿，静置10min,使其贴壁。3.用吸管将等量的PEG溶液滴在原生质液滴上，静置10-15min观察细胞的粘连。4.用刻度吸管向原生质液滴慢慢加入高PH高钙稀释液。第一次0.5ml,第二次1ml，第三四次各2ml,每次间隔5min。5.平皿微倾斜，吸取上清液，缓缓加入4ml高PH高钙稀释液,静置5min后弃去上清液。6.加入MS培养基4ml,静置5min后弃去上清液。7.每皿加入4mlMS培养基，摇匀。1.3.封口，20℃2结果与分析两细胞融合现通常分为五个阶段：①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。 图1图2 图1：离心后的原生质条带图—中间部分图2：原生质融合图×103讨论(1).所有在此实验中所使用的器材都要灭菌(2).金盏菊花瓣一定要撕成很细的细丝，使之与酶A充分接触，使原生质体彻底分离(3).在酶解的过程中每半个小时摇动小瓶使花瓣充分与酶A接触(4).实验过程中移液管和胶头滴管不能混用，防止相互污染。参考文献[1]郭晓华,那宁馨.新疆杨组织培养技术的研究[J].中国农学通报,2002,18(3):25-26.[2]李向辉.植物遗传操作技术。科学出版社。1998。177-184[3]孙勇儒，遗传学手册。湖南科学技术出版社，1989,447-448[4]王金发，细胞生物学实验教程[5]ScitzH

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