第二讲 整体动物试验概述-2015

第二章

整体动物实验概述

SummaryofAnimalExperiment中南大学公共卫生学院卫生毒理学系

钟才高

2015.3.20

内容

动物实验的重要性

一、动物实验概述

1.相关概念

2.动物实验在生物医学研究中应用

3.动物实验的优点与局限性

4.动物实验发展趋势

二、动物实验基本要素

1.受试动物

2.受试因素

3.实验效应苏联著名生理学家巴甫洛夫指出：

（1904年，诺贝尔奖获得者）

“没有对活体动物的实验研究，人们无法

认识活体人的各种生命现象”

动物实验的重要性：1966年诺贝尔生理或医学奖获得者（弗朗西斯.佩顿.鲁斯）

Francis

PeytonRous（1879-1970）attheRockefellerInstituteforMedicalResearchintheUShadisolated,fromchickens,Roussarcoma（retro）virus(RSV),whichcausedtumours

inanimals.Rouswentontopioneerresearchintotherabbitpapillomavirusanditsinteractionswithchemicalcarcinogensinthe1930s,andreceivedaNobelPrizeforhisworkin1966.Intheearly1960sLudwigGrossinNewYorkdemonstratedthatretrovirusescausedtumoursinmiceandrats.洛克菲勒（美）病毒诱导肿瘤的动物试验研究

20世纪80年代后

有三项诺贝尔生理学或医学奖：

(与动物试验有关的研究)

1980年美国Jackson研究所Snell发现的

“组织相溶性基因”

1984年英国C.Milstein发明的“用杂交

瘤技术制备单克隆抗体”

1996年澳大利亚Koherty发现的“T淋巴

细胞识别入侵微生物机制”

21世纪2项诺贝尔生理学或医学奖

2008年病毒（HPV、HIV）致病机制研究

2011年免疫系统的关键机制研究

（实验研究均涉及到动物试验）2008年诺贝尔生理学或医学奖获得者2011年诺贝尔生理学或医学奖获得者

2005年9月22号，女性频道“红尘惊奇”栏目-开颅者之死：报道了四川泸州医学院附属医院“开颅戒毒手术者投诉”。（开颅戒毒的背景）

开颅手术158例，记者采访18例手术者（投诉者）

手术后病人出现：

①毒瘾复发；

②人的性格改变；

③正常生理功能改变（动作变慢、记忆力下降等）

医院方存在的问题：

①夸大手术成功率；

②手术后病人继续服戒毒药“纳曲酮”。“开颅戒毒”争议的启示开颅戒毒手术后病人

动物试验

专家论证

（有效）

临床试验

专家论证

（成熟、安全、可靠）

临床推广应用临床医学研究程序-“新技术应用”理论依据第一节

动物实验概述

一、基本概念

动物实验(animalexperimentation)

是以实验动物为受试对象的科学实验。

内容包括：

1.以实验动物群体反应为评价指标的试验；

2.以实验动物生物学特征为观测指标的试验；

3.以实验动物组织器官或细胞或亚细胞结构为

研究材料的试验。

4.在动物身上施加某种处理的试验。动物实验方法

(animalexperimentalmethods)

如何用实验动物进行科学研究。

内容包括：

1.如何进行动物实验设计（实验组、剂量、观察指标等）

2.如何选择实验动物（种属、品系、年龄、性别等）

3.如何对动物施加处理因素（给药方式、频率、时间）

4.如何检测受试动物的生物学特征变化

5.如何评价受试因素产生的实验效应等。

实验动物（Laboratoryanimal）

是指能用于科学实验研究的动物。

实验动物的特定含义：

1.必须人工培育，遗传背景明确，来源一致；

2.所携带的微生物、寄生虫可实行人工控制；

3.能观察受试物的实验效应。

（如：观察呕吐反应用犬做试验）实验动物基本要求：

1.受试动物对处理因素有极高的敏感性；

（如：噪声对耳蜗神经的毒性试验，化学物质的致敏试验均用豚鼠进行试验）

2.受试动物对处理因素反应有极强的均一性；

（如：兔子眼睛对化学物质的刺激性）

3.受试动物遗传特征具有极强的稳定性；

4.受试动物具有极易的获得性。

动物实验技术

（Animalexperimentaltechnique）

指进行动物实验时所实施的各种操作技术。

内容包括：

1.实验动物处置技术（抓取、固定、编号标记、给药等）

2.动物组织标本制作技术；

3.生物材料样本收集技术（血液、粪便与尿液收集等）

4.实验效应检测技术；

5.实验动物本身的培育技术等。

动物实验的实验效应实例

受试因素实验效应四氯化碳谷丙转氨酶(GPT)

铅尿-ALA一氧化碳血液COHb含量

有机磷农药全血胆碱酯酶活性

氨茶碱血压比较医学（comparativemedicine）

将动物试验或动物模型获得的实验效应，与人类的基本生命特征或异常现象进行比较，以研究人体生物医学的科学（将动物试验的结果推到人）。

动物试验是比较医学研究的重要方法与手段。

常见实验动物与人生物特征参数比较

动物种类染色体(对)解剖特征生理特征肝(叶)肺(叶)心率(次/min)凝血时间(sec)人235575（50-100）12猴2165-7150（120-180）--狗3977120（110-130）8.6兔2257205（123-304）5.0大鼠2165328（216-600）5.5小鼠2045600（323-730）--二、动物实验在生物医学研究中的应用

1.人类疾病机制研究-“疾病动物模型”

2.临床新技术开发（器官移植、微创手术、诊疗仪器开发）

3.新药药理学研究

4.健康相关产品安全性毒理学评价

5.生物制药（如地鼠肾制备乙脑、狂犬疫苗）

6.军事医学研究（如生化武器杀伤力、太空生理测试）

7.环境与食品的健康安全监测。农药登记毒理学试验方法（18/19为动物试验）食品安全性毒理学评价试验方法（14/17为动物试验）产品种类试验总数（项）动物试验（项）占百分比（%）备注食品171482.4农药191894.7致突变试验：4/5化妆品171694.1消毒剂121191.2致突变试验：5/8化学品262492.3健康相关产品安全性评价的动物试验农药致突变试验：Ames试验、小鼠骨髓多染红细胞微核试验、哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验、显性致死突变试验、小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验。三、动物实验的优点与局限性：

(一)动物实验的优点

①可进行损害性或破坏性的实验操作；

②不受受试对象缺乏的影响，不怕失败，伦

理与法律限制相对较少；

③可严格控制实验条件；

④实验效应在一定程度上能外推到人。

与人体试验比较

常见破坏性动物试验有：

疾病模型复制试验

安全性毒理学试验

外科手术技能训练试验

临床新技术开发试验

武器杀伤试验等(二)动物实验的局限性

①实验动物不能表达受试因素引起的主观感

觉反应（如疼痛、口干、听力）；

②动物实验结果外推到人有时具有误导性和

不全面性（如“反应停”事件）；

③动物实验与体外试验比较，实验时间长，

费用高，不易重复。

四、我国动物实验的发展趋势：

1.动物实验管理规范化

2001年国家科技部等8部委颁布了《实验动物许可证管理办法》

2.动物实验方法标准化

3.动物实验模型商品化

4.动物实验工作伦理化

---人道地使用动物

---“3R”原则

1959年，英国动物学会出版了

《PrinciplesofHumanExperimentalTechnique》

（人道实验技术原则）

1966年，美国国会参众两院通过了

《AnimalWelfareAct》

（动物福利法案）替代法(alternatives)又称“3R"法：1.优化(refinement)

--对实验方法和技术进行优化（一体多用）

2.减少(reduction)

--减少受试动物数量和减轻动物痛苦3.取代(replacement)

--用细胞、微生物、线虫等受试生物替代整体动物试验。

第二节

动物实验基本要素

动物实验基本要素：

受试因素

受试对象

实验效应

（研究因素）（生物学特征改变）

（处理因素）

(受试动物)

一、受试因素（受试物）1.受试物溶液配制

溶剂和助溶剂要求：1.不与受试物发生化学反应；2.不对实验效应产生影响；3.在使用中不发生降解；4.不影响受试物稳定性。

常用溶剂与助溶剂：

1.溶剂：水（生理盐水、蒸馏水等）植物油（玉米油、橄榄油等）2.助溶剂：吐温-80或吐温85羧甲基纤维素、月桂醇硫酸钠等

受试物配制方法：

灌胃量要求：

常规灌胃量

小鼠0.1ml-0.2ml/10g体重

大鼠0.5ml-1.0ml/100g体重

兔＜100ml/2kg体重

狗＜500ml/10kg体重

最大灌胃量（见表）

灌胃方式：

1.“等体积不等浓度”灌胃

2.“等浓度不等体积”灌胃灌胃给药染毒的药液配制A.等体积不等浓度药液配制

例1：按1ml/100g体重灌胃量,如何配制受试物药液？

剂量组：1000mg/kg100mg/kg10mg/kg

100mg/100g

受试物浓度：100mg/1ml10mg/1ml1mg/1ml

200g大鼠2ml2ml2ml

B.等浓度不等体积药液配制

例2：按1ml/100g体重灌胃量,如何配制受试物药液？

剂量组：1000mg/kg100mg/kg10mg/kg

100mg/100g

受试物浓度：100mg/1ml100mg/1ml100mg/1ml

200g大鼠2ml0.2ml0.02ml

要求：

①动物需单笼喂养；

②每日需计算进食量或饮水量；

③受试物应无异味，不挥发；

④受试物应不与食物发生化学反应；

⑤受试物在饲料中含量≯5%。

缺点：

①动物笼具需要量多;

②工作量很大；

③受试物剂量很难控制在所需水平;

喂饲法染毒含药饲料配制

例3：按100g体重动物每日摄食量10g计算,如何配制饲料？

剂量组：4000mg/kg400mg/kg40mg/kg

400mg/100g

饲料中

受试物含量：400mg/10g饲料40mg/10g4mg/10g

（4%）(0.4%)(0.04%)

200g大鼠20g饲料20g饲料20g饲料

2.受试物暴露途径

1.经口(胃肠道)(1)灌胃法(2)喂饲法(3)吞咽胶囊法

2.经呼吸道(1)自然吸入---“静式”与“动式”(2)气管注入

3.经皮肤--涂药

4.注射途径

---静脉、肌肉、皮下、腹腔注射等otherthan-除了，不同于首过效应(Firstpasseffect)：

是指受试物在进入血液循环以前，机体在受试物的接触部位对受试物的阻隔作用或生物转化作用（即进入血液的量小于给予量）。

吸收系数(Absorptioncoefficient)：

是指受试物被受试机体吸收入血的量与接触量之比。

经口灌胃

二、受试动物

(一)受试动物分类

按基因遗传学分类

1.近交系(inbredstrain)

2.封闭群(closedcolony)

3.突变系(mutantstrain)

4.杂交群(hybridstock)

按携带微生物分类

1.普通动物(CV)---一级动物

2.清洁动物(CL)---二级动物

3.SPF级动物(SPF)---三级动物

4.无菌动物(GF)---四级动物按基因遗传学分类：

1．近交系(inbredstrain)

是指连续20代以上兄妹交配（brother-sistermating，BXS）或亲子交配（Parent-offspringmating，PXO）培育而成的动物品系。

常见的近交系动物：

①普通近交系

②重组近交系

③同源突变近交系

④同源导入近交系

近交系动物的特点：

①基因型相同，表现型一致，近交系数大于99％；

②对受试物反应一致，实验结果重复性好，可比性强；

③遗传学背景明确；

④抵抗力差，对营养及饲养管理条件要求高；

⑤不同品系具有各自明显的特性。

2.封闭群(closedcolony)

它是指一个不从外界引入新的血缘，采用非近亲交配方式进行繁殖一定代次的实验动物种群。又称远交系(outbredstock)。

常见的封闭群有两类：

(1)近交系封闭群：由近交系种群采用非同胞交配至少连续繁殖4代以上的群体称近交系封闭群。

(2)非近交系封闭群：以非近亲交配方式在一定群体内连续随机繁殖15代以上的群体称非近交系封闭群。

封闭群动物具有以下特点：

①群体遗传特异性保持相对稳定；

②个体间具有杂合性，存在一定的差异；

③与人类群体遗传异质性相似；

④繁殖能力较强；

⑤生产成本低，生产量大，供应充足。

3．突变系(mutantstrain)

突变系(mutantstrain)是指由于遗传基因发生突变而表现出某种遗传缺陷的品系动物。

突变系动物的共同特点是：

①突变系动物因其突变多为病态；

②其生活能力较弱；

③饲养管理要求严格，繁殖保种较为困难；

④适用于某一疾病机制研究。

4．杂交群(hybridstock)

杂交群(hybridstock)又称异系杂交，它是由两个不同的近交品系杂交而繁殖的第一代动物，又称为杂交一代（简称F1杂交动物）。

杂交群动物的特点：

①它不具有育种功能；

②杂交F1代动物遗传和表现均一性好；

③生活适应能力较近交系动物强；

④具备亲代双亲的特点，应用范围大。

按携带微生物分类：

1.普通动物（conventionalanimals，CVA）

称一级动物。

特点：

①不带有动物烈性传染病和人兽共患病病原体;

②对实验的反应性较差，实验结果不可靠，仅可供

教学示范及作为预备试验之用。

饲养要求：

①饲养于普通环境；

②全价饲料饲养；

③饮水水质应符合国家规定的生活饮水卫生标准；

④饲料与垫料要消毒，室内温度与湿度能人工控制；

⑤能防止蚊蝇等昆虫及野鼠进入;

⑥饲养环境应定期清洁消毒。

物种来源于清洁动物或SPF动物。

2.清洁动物（cleananimals，CLA）

又称二级动物，除不带有普通动物应排除的病原体外，还不应携带对动物危害大和对科学实验干扰大的病原体。

饲养要求：

①必须饲养于半屏障环境中或屏障环境中；

②饲料、饮水、垫料、笼具等均须消毒；

③工作人员需更换灭菌工作服、鞋帽、口罩等后工作；

④饲养环境必须能控制温度、湿度、光照强度与时间。

物种来源于SPF动物或无菌动物。

3.SPF动物

（specificpathogenfreeanimals,SPFA）

又称三级动物，除不带有普通动物、清洁动物应排除的病原体外，还应排除潜在感染或条件性致病的病原，以及对科学实验干扰大的病原体。

饲养要求：

①必须饲养于屏障系统环境中；

②饲料、饮水、垫料、笼具等必须灭菌

③操作人员必须严格执行操作规程；

④保种最好饲养于隔离器中。

物种来源于无菌动物或悉生动物。4.无菌动物(germfreeanimals，GFA)，

又称四级动物，指采用当前手段无法检出一切其他生命体的动物。

悉生动物(gnotobioticanimals，GNA)

又称已知菌动物，是将已知菌植入无菌动物体内，因植入菌类数量不同分为单菌动物、双菌动物和多菌动物。

饲养要求：

①必须饲养于隔离的无菌环境；

②饲料、饮水、笼具必须严格灭菌，确保无菌；

③饲料中的营养成分必须齐全，满足无菌动物的需要，特别是维生素等营养物质。

物种来源于剖腹产或无菌卵的孵化。

（二）受试动物选择

1.动物种属的选择

选择原则：

（1）相似性原则

（2）特殊性原则

（3）标准化原则

（4）经济性原则相似性原则

相似性原则是指利用动物与人类生命现象（如机能、代谢、结构及疾病等特点)的相似性来选择实验动物。

例如：

皮肤烧伤模型的实验动物---小型猪

因为小型猪的皮肤组织结构与人类相似，其上皮再生、皮下脂肪层、烧伤后的内分泌及代谢等也类似人体。

自发性高血压模型动物-SHR大鼠SHR---spontaneouslyhypertensiverat特殊性原则特殊性原则是指利用不同种系实验动物机体存在的特殊结构或某些特殊反应选择解剖、生理特点符合实验目的和要求的动物。

例如：

热源试验-家兔

呕吐试验-家犬、猴和猫

过敏性试验-豚鼠

耳毒性试验-豚鼠

观察切除甲状旁腺后的生理现象-犬标准化原则标准化实验原则是选择遗传背景明确，具有已知疾病或模型性状显著且生物学特征隐定的动物进行实验。

例如：

许多突变品系动物具有与人类相似的疾病或缺损。经济性原则经济性原则是指尽量选用容易获得、价格便宜、容易饲养又能符合实验要求的动物进行实验。

动物种属：

啮齿类动物-小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠

特点：繁殖周期短，具多胎性，饲养容易，

遗传和微生物控制方便，经济。

非啮齿类动物-狗、家兔、猪。

非人灵长类动物-猴、猩猩等2.动物个体的选择

1.年龄

（根据试验目的与试验周期长短选择）

2.体重

3.性别

（根据受试物的用途不同选择性别）

4.生理及健康状况

三、实验效应(一)毒效应观察指标1.一般性指标动物体重、食物消耗量、食物利用率、中毒症状、脏器系数等

2.生理生化指标血液学指标、血液生化指标、尿液指标等。

（特异性指标）3.病理学指标4.死亡指标5.特殊性指标（致癌率、致畸率等）

食物利用率：指动物每食入lOOg饲料所增加的体重克数(g)即用“g体重／lOOg饲料”表示。食物消耗量：

指动物每公斤体重所消耗的饲料重量(g)。即用“g饲料／kg体重”表示。

脏器系数（又称脏／体比值）：

指受试动物某个脏器的湿重与其体重的比值，通常用每lOOg体重中某脏器所占的重量。即用“g脏量／100g体重”表示。(二)毒效应评价参数1.急性毒性评价指标(1)绝对致死剂量（absolutelethaldose，LD100）是指化学毒物或药物引起全部受试动物死亡的最低剂量。(2)最小致死剂量（minimallethaldose，LD01）是指化学毒物或药物引起个别受试动物（1%）死亡的剂量。(3)最大非致死剂量（maximumnon-lethaldose,LD0）是指化学毒物或药物不引起受试动物死亡的最高剂量。