2-cp驯化前后厌氧颗粒污泥中微生物种群结构的变化

2-cp驯化前后厌氧颗粒污泥中微生物种群结构的变化

氯酚类作为重要的工业原料使用广泛。由于其毒性和易分解性对环境的污染面广、影响大，美国环境管理局（epa）和中国将氯酚类物质作为主要控制对象。与传统的物理、化学法和好氧生物处理技术相比，厌氧污泥微生物脱硅反应是减少氯酚类物质的有效途径。厌氧消化是多种微生物相互作用的过程，而酸菌和厌氧菌在厌氧器的运行中起着重要作用。因此，我们必须研究这些微生物的结构分布，了解这些微生物的生态，对顺利实施厌氧处理系统和提高有机物质的分解效率具有重要意义。由于传统研究方法的局限性,产甲烷菌的代谢作用还没有象其他类群的细菌那样被广泛研究,酸杆菌的确切功能和生态特性目前仍不是很明确.近年来,基于16SrDNA克隆技术鉴别微生物组成的方法已广泛应用于各种环境样品,这些方法无需分离培养就可以反映微生物的群落结构信息.本研究使用基于16SrDNA的克隆技术,从厌氧颗粒污泥直接提取总DNA,用古细菌和酸杆菌特异性引物进行PCR扩增、克隆、测序及序列分析等,以考察经2-CP驯化前后厌氧颗粒污泥中古细菌和酸杆菌的种群结构变化,以期为在分子生物学水平上阐明降解2-CP厌氧污泥颗粒的微生物种群信息、提高有机物的厌氧降解效率提供一定的理论依据.1材料和方法1.1cod和2-cp的驯化接种污泥选用无锡罗氏柠檬酸厂IC厌氧反应器污泥.反应器内径50mm,外径80mm,总高度400mm,有效容积0.75L.用葡萄糖和2-CP共同驯化,进水COD控制在2000mg/L左右,并按比例加入所需的营养盐.水力停留时间(HRT)控制在12h左右,pH为7.5～8.0,温度为37℃±1℃.当进水2-CP浓度达到25mg/L,COD和2-CP的去除率>90%时说明驯化成功.COD的测定采用国家标准法(GB11914-89),MLSS和MLVSS的测定采用重量法,2-CP测定用高效液相色谱(HPLC)法.1.2总dna的提取和测定取接种污泥及厌氧反应器内经2-CP驯化稳定后的污泥各200mg,用蒸馏水冲洗3遍,5000r/min离心2min弃去上清,用蛋白酶K、氯仿/异戊醇方法直接抽提污泥样品的总DNA,提取的总DNA中用100μL无菌超纯水溶解,加入RNAase(终浓度100μg/mL),37℃温育30min.总DNA片段的大小和质量用0.8%的琼脂糖凝胶电泳(DYB-Ⅰ型电泳仪)检验,用紫外分光光度计(BioPhotometor,Eppendorf公司)测定浓度为150μg/mL.1.31pcr扩增程序为考察厌氧颗粒污泥中古细菌和酸杆菌在2-CP驯化前后的分布情况,使用古细菌特异性引物和酸杆菌特异性引物扩增16SrDNA,引物由Invitrogen生物技术有限公司合成,具体信息见表1.PCR反应在MastercyclerGradient(Eppendorf公司)上进行,50μL的反应体系为:10×PCR反应缓冲液5μL,10mmol/L的dNTP溶液1μL,10mmol/L的引物对各1μL,Taq酶2个单位,样品DNA溶液2μL,加无菌双蒸水补足至50μL.古细菌的PCR扩增程序为:94℃预变性2min;94℃,45s,51℃,60s,72℃,90s,30个循环;72℃,10min.酸杆菌的PCR扩增程序为:94℃预变性2min;94℃,45s,60℃,45s,72℃,90s,30个循环;72℃,10min.PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检验后,割下目标片段大小的条带,用胶纯化回收试剂盒进行回收和纯化(WizardSVGelandPCRClean-UPSystem,Promega公司),用紫外分光光度计测定纯化后的PCR产物浓度.1.4质粒的筛选、pcr和测序按操作说明,将纯化后的DNA片段克隆至pMD19-TVector(Takara公司)上,取适量转化菌液涂布在选择性LB琼脂平板上,37℃培养过夜(18h)以筛选含重组质粒的白色克隆子.为进一步验证筛选出的白色克隆子是否为阳性,挑取白色菌斑于94℃煮沸2min以获得质粒DNA,分别用古细菌和酸杆菌引物,按照1.3节中的条件做PCR(25μL反应体系),产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳验证.把经2次PCR验证并确定含目标DNA片段的白色克隆子接种于2mL的LB母液(含50μg/mL氨苄青霉素)中,180～220r/min摇床振荡培养过夜(37℃,18h),培养后的菌液送上海生工生物技术有限公司测序.2结果与讨论2.1微生物对2-cp的降解能力污泥的驯化过程中逐步提高进水中2-CP的浓度,使微生物逐渐适应2-CP的毒性并具有降解2-CP的能力.从图1可以看出,驯化初期污泥对2-CP的降解能力有限,虽然进水中2-CP浓度很低,但出水中仍然有2-CP检出.从第10d以后,随着驯化过程的进行微生物对2-CP的耐受性逐渐增强,具有2-CP降解能力的微生物逐渐繁殖增长,使得污泥降解2-CP的能力逐步提高.在本研究的驯化过程中,COD的去除率基本稳定在85%～95%,当2-CP的去除率>90%时说明驯化成功,驯化过程约60d.2.21pcr扩增dna提取的总DNA大小约为23kbp,用古细菌特异性引物和酸杆菌特异性引物进行PCR扩增,分别得到大小约为930bp和870bp的DNA片段.2.2.1-cp诱导的厌氧污泥微生物群落结构变化取接种污泥和2-CP驯化后的污泥样品用古细菌特异性引物进行PCR扩增、克隆以及再次验证后,各挑取33个阳性克隆子的菌液去测序.测序结果与NCBI的核酸数据库已有的基因序列进行比对,结果如表2和表3所示,2-CP驯化后厌氧颗粒污泥古细菌的系统发育关系如图2所示.分析表明,2-CP驯化前后厌氧颗粒污泥中存在7个共有的古细菌菌种(见表2):Methanothrixsoehngenii、Methanosaetaconcilii、unculturedeuryarchaeote及unculturedarchaeon等,并且Methanothrixsoehngenii在污泥微生物中的丰度由驯化前的45%提高到了驯化后的93.9%,unculturedarchaeonTA05、unculturedarchaeonTA04和unculturedarchaeonTA01在污泥微生物中的丰度分别由驯化前的50%、45%和45%提高到了驯化后的93.9%、90.9%和57.6%.与驯化前相比,经2-CP驯化后的厌氧污泥中出现了一些特有的古细菌菌种(见表3),如unculturedMethanomicrobiaceae、Methanobacteriumsp.SA-12、Methanobacteriumaarhusense、Methanobacteriumcurvum及Methanobacteriumbeijingense等,而接种污泥中特有的一些古细菌菌种发生了消亡,如unculturedarchaeonGA55、unculturedarchaeonZAR123及unculturedarchaeonisolateMUAHR等.厌氧颗粒污泥在经过2-CP驯化后,检出的古细菌菌种由驯化前的18个增加到23个,其中增加了16个新的古细菌菌种,而接种污泥中原有的11个古细菌菌种在驯化后消亡.这说明2-CP的驯化造成了厌氧颗粒污泥中古细菌群落结构的变化,能适应或能降解2-CP的古细菌经过驯化后得到加强,不能适应的古细菌种群则被削弱甚至消亡,使得古细菌种群分布更为丰富,以适应新的厌氧体系.据资料报道,在UASB等厌氧反应器中甲烷菌的优势菌多为Methanosaetaconcilii和Methanothrixsoehngenii,本研究的结果与之相符.McHugh等对低温(10℃～14℃)、中温(37℃)和高温(55℃)下的厌氧颗粒污泥反应器中甲烷菌种群结构进行分析,确定这些厌氧反应器中优势菌种为Methanosaeta(甲烷毛状菌属),并在低温厌氧反应器中发现了新的微生物.Godon等对处理酿酒废水的流化床反应器中包括真细菌、古细菌、原核生物、真核生物等的微群落结构进行分析,确定该反应器中95%的古细菌种群属于Methanosarcina(甲烷八叠球菌属)和Methanobacteriaceae(甲烷杆菌科).2.2.2厌氧颗粒污泥2-cp诱导、2-cp诱导、16sraft改革和16s-vector的关系酸杆菌在环境中分布广泛、形态表现丰富多样,在土壤、温泉及海水等许多生态系统中都曾检测到酸杆菌的存在.土壤中超过30%甚至50%的16SrDNA克隆文库中的序列都属于酸杆菌,纯培养的酸杆菌只有很少一部分,除Acidobacteriumcapsulatum、Holophagafoetida及Geothrixfermentansv3个可培养的属之外,关于酸杆菌的种群信息大部分是未知的,据报道酸杆菌可能属于甲醇代谢类细菌.取接种污泥和2-CP驯化成功后的污泥样品用酸杆菌特异性引物进行PCR扩增、克隆以及再次验证后,各挑取30个阳性克隆子的菌液去测序.测序结果与NCBI核酸数据库已有的基因序列比对,结果如表4和表5所示,2-CP驯化后厌氧颗粒污泥酸杆菌的系统发育关系如图3所示.对该厌氧体系酸杆菌的分析结果表明,2-CP驯化前后的厌氧颗粒污泥中存在共有的微生物菌种(见表4):unculturedbacterium、unculturedAcidobacterium和unknownActinomycete(MC9).其中,unculturedAcidobacteriumgroupbacteriumYNPRH5A和unculturedbacteriumSHA-18在厌氧颗粒污泥中的丰度分别由驯化前的80%和93.3%下降到62.1%和58.6%,而unculturedbacteriumisolateALT40和unknownActinomycete(MC9)均由驯化前的3.3%提高到了27.6%和6.9%.如表5所示,2-CP驯化后,原接种污泥中特有的微生物Desulfotomaculumsp.176、unculturedDeltaproteo-bacteriumn8d及unculturedhydrocarbonseepbacterium等发生消亡,并出现了特有的微生物unculturedHolophaga/Acidobacterium、unculturedAcidobacteriabacterium以及unidentifiedAcidobacterium.厌氧颗粒污泥经过2-CP的驯化后能重新调整原有的酸杆菌种群结构,在产生新种群的同时,部分旧种群被削弱或消亡以适应环境的变化.本研究用酸杆菌特异性引物进行PCR扩增,测得序列与GenBank中已有基因序列进行比对后,发现与unknownActinomycete(放线菌)、Desulfotomaculumsp.(厚壁菌门的脱硫肠状菌)及unculturedDeltaproteobacterium(变形杆菌门的δ-变形杆菌属)有较高的相似性(见表4和表5).Sait等对土壤酸杆菌进行了研究,在125个克隆子中发现有4个克隆子所代表的微生物不属于酸杆菌,它们分别是Actinobacteridae(放线菌门的放线菌纲)、Alphaproteobacteria(变形杆菌门的α-变形杆菌纲)和Betaproteobacteria(变形杆菌门的β-变形杆菌纲)以及Sphingobacteria(拟杆菌门的鞘脂杆菌纲).基于16SrRNA的系统发育关系,有资料报道酸杆菌和变形杆菌具有近缘关系.Quaiser等认为Acidobacteria(酸杆菌门)、Proteobacteria(变形杆菌门)和Firmicutes(厚壁菌门)的嘌呤操纵子结构相似,是因为它们起源于三者共同的祖先.本研究中测得的序列与GeneBank中已有基因序列的相似性在较低的87%～94%的范围,有可能代表一些新的酸杆菌,有待进一步研究.利用基于16SrDNA的克隆方法无需分离培养就可以反映微生物的群落结构信息.本研究曾尝试利用单酶切和双酶切获得目标DNA片段,多次酶切失败后发现,很多酶的酶切位点与细菌PCR扩增所用引物序列重合,因此酶切后无法得到目标DNA片段.于是直接把目标DNA片段克隆到T-vector,结果证明这种方法是可行的.3-cp的驯化(1)2-CP驯化前后厌氧颗粒污泥中存在共有的古细菌菌种:Methanothrixsoehngenii、Methanosaetaconcilii及unculturedeuryarchaeote等.与驯化前相比,经2-CP驯化后的厌氧污泥中出现了一些新的微生物,如Methanobacteriumaarhusense、Methanobacteriumbeijingense及Methanobacteriumcurvum等,而接种污泥中特有的一些古细菌发生了消亡.(2)2-CP驯化前后的厌氧颗粒污泥中存在共有的微生物菌种:unculturedbacterium、unculturedAcidobacterium和unknownActinomycete(MC9).经2-CP驯化后,接种污泥中特有的微生物Desul