基于16srdna序列分析技术的降解五氯酚颗粒污泥微生物种群多样性研究

基于16srdna序列分析技术的降解五氯酚颗粒污泥微生物种群多样性研究

氯酚（pcp）是一种高度发育、致死于副作用的难生物降解疾病的新型制剂。作为一种调理剂和杀菌剂，它经常被广泛应用于皮革、纺织、造纸和其他废水中。微好氧污泥技术将厌氧与好氧结合起来，让好氧氧化和好氧还原同时发生，不仅可以节省空间，缩短手术周期。这是一种新型的废水处理技术。颗粒污泥内部的微生物生态特征和颗粒污泥对水污染物的处理效率直接相关,全面了解降解五氯酚的微好氧颗粒污泥中微生物种类、数量及其动态性,认识细菌群落的稳定性和功能性等特征具有重要作用.传统的微生物法用于环境生物学研究时环境中只有不超过10%的微生物可以培养.16SrDNA为细胞所共有;其功能同源且最为古老;既含有保守序列又含可变序列;分子大小适合操作;它的序列变化与进化距离相适应,16SrRNA序列分析作为微生物分类系统的主要依据也得到了广泛认同.16SrDNA技术应用于PCP的研究在国内外已多见报道,TARTAKOVSKY等通过16SrDNA技术分析和鉴定了2种降解PCP的菌;曾光明等通过16SrDNA分析微生物群落组成的变化评价和预测堆肥成熟和PCP污染的指标;李向丽等应用16SrRNA基因克隆文库方法对PCP厌氧生物降解体系中细菌群落的组成和相对丰度进行了研究,进一步拓宽了对PCP降解微生物多样性的认识.然而通过比较DEEG条带强度的相对变化从而定量研究PCP对污泥中细菌群落动态变化未见报道,本研究通过定量分析污泥中各种菌的相对数量变化,为解析微氧颗粒污泥的微生物群落结构与群落动态,从而发现降解PCP的优势菌群,为进一步探索微氧颗粒污泥中微生物降解五氯酚的机理提供依据.1材料和方法1.1微好氧颗粒污泥污泥样品培养参考文献,分别取自微好氧颗粒污泥反应器,包括接种污泥、微好氧颗粒污泥以及用PCP驯化后的成熟颗粒污泥.其中微好氧颗粒污泥取自溶解氧低于0.6mg/L的情况下在微好氧颗粒污泥发生器中培养60d的污泥,PCP驯化的成熟颗粒污泥取自用PCP从0.2mg/L增加到6mg/L的废水对微好氧颗粒污泥驯化培养120d的污泥.每次取样约500mg,于5000r/min离心5min后弃去上清液备用.1.2古细菌的pcr扩增颗粒污泥总DNA提取参考文献,真细菌PCR扩增对象为真细菌16SrDNAV3可变区,其引物为:上游引物为:5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’;下游引物为:5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’.古细菌PCR扩增对象为古细菌16SrDNAV3可变区,其引物为:上游引物为:5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGTCCAGGCCCTACGGGG-3’;下游引物为:5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’.PCR的反应程序:94℃预变性4min,94℃变性0.5min,52℃退火1min,72℃延伸0.5min,30个循环,最后72℃延伸7min.PCR反应体系中基因组0.5μL,10×Buffer(含2.0mmol/LMgCl2)5.0μL,dNTP(10mmol/L)1.0μL,上游引物(10μmol/L)1.0μL,下游引物(10μmol/L)1.0μL,Taq酶(5U/μL)0.25μL,ddH2O41.25μL.1.3ccctagppaagc基因变性梯度凝胶电泳及测序构建系统发育树参考文献,扩增过程中真细菌的引物为:上游引物:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’;下游引物:5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’.古细菌的引物为:上游引物:5’-TCCAGGCCCTACGGGG-3’;下游引物:5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’.2结果与讨论2.1化树生长的稳定性将3种颗粒污泥样品中真细菌和古细菌DGGE图谱的主要条带进行切胶回收并测序,分别得到6个和5个可用序列进行序列同源性分析.采用邻接法构建系统进化树.对进化树树形的稳定性进行检测,输出60%以上的数值(图1、图2).从真细菌进化树可以看出,6个测序的条带主要可分为4大类群:Band4、19、25之间的同源性较高,可归为GroupⅠ;Band16可归为GroupⅡ;Band17可归为GroupⅢ;Band37可归为GroupⅣ.从测序的条带进化树看出,古细菌可分为3大类群:Band26、27、28之间的同源性较高,可归为GroupⅠ.Band9可归为GroupⅡ;Band21可归为GroupⅢ.2.2微生物多样性变化DGGE条带的强弱反映了相对的数量,通过BandScan软件对3种不同颗粒污泥中的真细菌和古细菌DGGE图像进行分析,得到真细菌和古细菌主要条带的强度图(图3、图4).利用Shannon多样性指数计算公式得出真细菌的在接种污泥、微好氧颗粒污泥、PCP驯化的微好氧颗粒污泥的指数分别为2.09、2.61、2.55,结合真细菌DGGE条带强度图发现接种污泥在微好氧条件下出现新的条带如Band4、16、25、37;但同时还有一些真细菌不适应微好氧条件,条带消亡如Band19,说明它代表的细菌不能适应微好氧的环境而逐渐被淘汰.Band16、25不适应PCP驯化而消亡从而使多样性指数下降,说明这些条带代表的细菌能够很好的适应微氧的条件,但是它们不能耐受PCP的毒性,在PCP的毒性环境中不能生存.Band4、37很可能是降解PCP的优势菌种,Band4与鞘氨醇单胞菌同源性很高,BEAULIEU等发现PCP污染的土壤中含有的微生物与鞘氨醇单胞菌有关.Band37与不可培养的放线菌同源性很高,放线菌可以生长在活性污泥中,形成稠的絮状泡沫,而且它们能够降解大量不同种类的有机化合物,对有机物的矿化有非常重要的作用.Band17其在培养过程中一直存在,它们可能对微生物的物质和能量代谢起着非常重要的作用.对古细菌Shannon多样性指数计算得出接种污泥2.53、微好氧颗粒污泥1.85、PCP驯化微好氧颗粒污泥1.84,说明部分古细菌不能适应微好氧环境而消亡如Band26、27,但它们在PCP驯化的微氧颗粒污泥中则有所增加,很可能是降解PCP的有效菌种.微好氧颗粒污泥和PCP驯化颗粒污泥多样性变化不大,如Band21很可能是降解PCP的优势菌群,它与不可培养的产甲烷古菌具有高达100%的同源性,任艳红等曾在降解五氯酚的厌氧反应器中分离测序得到产甲烷菌,对PCP的降解具有非常重要的作用;吴唯民等也对具有还原脱氯性能的颗粒污泥内微生物进行了鉴定,主要有利用乙酸盐的产甲烷菌、利用氢的产甲烷菌.DGGE条带强度图表明Band9是PCP驯化后颗粒污泥中新增的特异性条带,这个条带代表的细菌与鞘氨醇单胞菌同源性很高,可以有效降解五氯酚.Band28一直存在但呈现不断下降的趋势,说明这一类古菌不能适应微氧的环境或者是PCP的毒性环境,而逐渐减少.3对五氯酚降解的优势细菌和古菌(1)构建了真细菌和古细菌的系统进化树,真细菌测序的条带可分为4大类群,古细菌测序的条带可分为3大类群.(2)通过比较不同菌