温度对温泉中古细菌多样性的影响

温度对温泉中古细菌多样性的影响

0古细菌群落的组成长期以来，古细菌的一些奇怪习惯和潜在生物研发的前景引起了人们的关注。1990年Woese提出了“三域分类学说”,即将生物界分为真核生物(Eucaryota)、真细菌(Bacteria)和古细菌(Archaea)三域。在rRNA进化树上,古细菌可分为泉古菌门(Crenarchaeota)、广古菌门(Euryarchaeota)以及未确定的初古菌门(Korarchaeota)和纳古菌门(Nanoarchaeota),其中研究相对深入的是泉古菌门和广古菌门。目前自然界中已知的可培养微生物仅占0.1%～10%,即便是得到了纯培养,其形态和生理也可能发生很多变化。因此,分子生物学技术已成为研究微生物生态学行之有效的方法,为揭示自然环境微生物多样性提供了一条新的途径。古细菌域的分子生态学分析显示许多未培养的古细菌主要分布在陆地温泉、淡水湖泊、沿海或深海水域、海底沉积物或热溢口以及土壤环境等。我国是个温泉资源丰富的国家,总体上看,主要分布在西藏、云南、广东、福建、四川以及东部的台湾省等地区,在华北燕山山区也出露有近30个温泉,这为我们开展温泉古细菌多样性的研究提供了丰富和宝贵的资源。目前学者们对温泉微生物生态学的研究主要集中在高温和超高温环境中,对中低温环境的研究还相对较少。国际上对陆地温(热)泉高温菌研究比较深入的主要是美国黄石国家公园温泉,以及冰岛和日本的一些高温温泉,而国内对云南腾冲热海的温泉研究开展较早,也较为系统,但对华北地区的温泉研究甚少。本研究组前期曾对华北承德地区温泉中细菌的多样性水平进行了初步研究,发现其细菌群落结构与其他地区的温泉相比存在一定的差异,而且其中的某些菌种还可以通过自身的代谢来影响温泉泉华的形成,证明该地区温泉中细菌群落的组成较为特殊。但承德地区温泉中古细菌群落的组成是什么?它们在温泉生态系统中扮演着什么角色,是否和细菌群落有相互作用?目前还未见相关报道。本研究通过构建古细菌的16SrDNA克隆文库,对我国华北承德地区两个不同温度的温泉(61.4℃和74.5℃)中古细菌的多样性及系统发育关系进行了分析,研究结果可为该地区温泉生态系统的进一步深入研究提供可靠的依据。1材料和方法1.1水质、水资源量样品采集于2010年6月28—29日,采样地点为河北承德地区两个不同温度的温泉:围场县山湾子温泉(A12)和隆化县七家温泉(A14)。山湾子温泉出露于河谷中部,来自下部花岗岩破碎带的热水穿过浅部第四系沉积物而涌出地面。七家温泉的出露受到北东向断裂控制,现地表已没有泉眼,由钻孔在原泉眼处抽取地下热水。水样采集后装于无菌瓶中,储存于4℃保温箱中,尽快返回实验室进行操作。温度、pH、高程等参数现场测定(表1),其他物理化学参数测定由北京市地质工程勘察院实验室完成。1.2总dna的提取取1L水样于孔径为0.22μm的细菌滤膜上进行真空抽滤,将滤膜浸泡于10mL无菌生理盐水中,超声波振荡10min,然后用移液枪反复吹打使膜上细胞完全进入溶液中。使用离心机10000r/min离心3min收集菌体。用环境基因组DNA提取试剂盒提取水样中的总DNA(参照MPBio试剂盒说明书),提取产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。最后将提取的总DNA置于-20℃下保存。1.3相关基因片段的pcr扩增以基因组DNA为模板,使用古细菌通用引物对ARC21F(5′-TTCYGGTTGATCCYGCCRGA-3′)和ARC968F(5′-YCCGGCGTTGAMTCCAWTT-3′),PCR扩增样品中的相应基因片段。PCR扩增程序为:95℃预变性5min,94℃变性30s,52℃退火30s和72℃延伸1min,共35个循环,最后在72℃下延伸7min。PCR反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。1.4pcr扩增筛选将PCR产物通过克隆试剂盒连接到pEASY-T1克隆载体上,并热激转化到Trans1-T1感受态细胞中,然后涂布在含有Amp/X-Gal/IPTG的LB平板上,于37℃下静置培养16h。随机挑取白色克隆,重新纯化培养,并用特异性引物对M13M4(5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和M13RV(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)进行PCR扩增筛选插入片段。最后将鉴定出的阳性克隆送交中科希林生物科技有限责任公司完成测序。1.5序列筛选、系统发育树构建运用Bellerophon程序对获得的序列进行嵌合体的检验,删除嵌合体后用Dotur软件对剩余序列进行分类,最后运用BLAST程序将各类序列在GenBank数据库中进行相似性搜索,并下载相似性最高的序列和相似性较高的已知种的序列作为参考。将所有序列用BioEdit中的ClustalW程序进行处理后,用MEGA4.0软件构建系统发育树。本研究所得序列均已提交GenBank,序列登录号为JF830106-JF830119。2结果2.1不同强化项目的热泉比较根据《饮用天然矿泉水检验方法》(GB/T8538—2008),对山湾子温泉(A12)和七家温泉(A14)两个热泉中的钾、钠、钙、镁等34个项目进行分析,表1列出了部分实验结果。2.2dna片段大小及含量两个环境的样品总DNA的提取结果如图1所示,其中1为A12,2为A14。所提DNA的片段大小均约为23kb,表明已获得较为完整的基因组DNA。并且A260/280比值在1.83左右,说明DNA的纯度较高,可以直接用于PCR。2.31不同浓度模板pcr产物的表达两温泉样品中古细菌的16SrDNA基因片段扩增结果如图2所示。泳道1-1和1-2为A12加不同浓度模板后的PCR产物,2-1和2-2为A14加不同浓度模板后的PCR产物,CK为阴性对照。由图可知,两样品用古细菌通用引物对(ARC21F/ARC968F)进行PCR扩增均可以获得单一的目的条带,片段长度约900bp,无明显非特异性扩增现象出现。2.4建立克隆信息库两热泉样品的扩增产物经连接转化后,各随机挑取50个白色克隆建立克隆文库。用特异性引物对M13M4和M13RV进行插入片段筛选后,将鉴定出的阳性克隆进行测序,两个样品共得到78个序列。2.5强化、分类、序列及系统发育树运用Bellerophon程序检验并去除嵌合体后,将剩余序列通过Dotur软件进行分类,并绘制两文库的饱和曲线(图3)。从图3看出,最终可将获得的古细菌16SrDNA序列分成13种基因型(A12为3种,A14为10种),两文库分析均趋于饱和。将每种基因型的代表序列输入RDP网站,用Classifier程序确定其系统发育类群,结果表明(图4):A12(74.5℃)文库中16SrDNA序列分属3个类群,分别为Crenarchaeota(33.3%)、Euryarchaeota(62.5%)、UnclassifiedArchaea(4.2%)。A14(61.4℃)文库中的16SrDNA序列则分属2个类群:Crenarchaeota(88.5%)和UnclassifiedArchaea(11.5%),并没有广古菌门(Euryarchaeota)微生物的分布。由此可见,两热泉的优势种群不同,广古菌门(Euryarchaeota)是样品A12的优势类群,而泉古菌门(Crenarchaeota)是A14的优势类群。将每种基因型的序列输入NCBI网站,用BLAST程序在GenBank数据库中进行相似性比对,结果如表2所示。从表2中可以看出,七家温泉A14(61.4℃)的基因型种类远远高于山湾子温泉A12(74.5℃),表明温度是影响温泉中古细菌多样性水平的关键因素。通过BLAST比对发现,文库中序列与许多类似环境中的古细菌和环境克隆密切相关,如:A12-11(MethanosaetathermophilaPT)、A14-16(CandidatusNitrososphaeragargensis)、A14-22(CandidatusNitrosocaldusyellowstoniistrainHL72)、A14-31(Crenarchaeotalsp.clonepJP41)。其中,MethanosaetathermophilaPT是嗜热产甲烷古细菌,而CandidatusNitrososphaeragargensis和CandidatusNitrosocaldusyellowstoniistrainHL72是与氨氧化作用密切相关的古细菌。为了进一步了解这些古细菌的系统发育地位,除了数据库中同源性最高的序列之外,本研究还下载了一些同源性较高的已知菌种的序列,与所得序列构建了A12和A14两个温泉样品中古细菌类群的系统发育树(图5)。下面分别描述主要类群代表克隆的系统发育关系。(1)Crenarchaeota泉古菌门是古细菌的一个大分支,包括很多极端嗜热微生物。该类古细菌是A14(61.4℃)文库中的优势类群,占88.5%。包括8种基因型,而且这8个克隆均属于分类地位相对明确的热变形菌纲(Thermoprotei)。其中,克隆A14-1在A14文库中所占比例为37.2%,是该文库中最丰富的序列类型,它与UncluturedCandidatusNitrosocaldussp.的相似性达96%。UncluturedCandidatusNitrosocaldussp.是Nunoura等从日本Hishikari金矿的地下热水(60～70℃)中,利用宏基因组的方法推断出来的未培养微生物。该古细菌基因组含有一个16S/23SrRNA操纵子和44个编码蛋白的基因。UncluturedCandidatusNitrosocaldussp.可能在地下热水的硝化过程中起着重要的作用。A14-22在A14文库中所占比例为34.3%,是该样品的第二丰富的基因型。通过BLAST比对发现,该克隆与CandidatusNitrosocaldusyellowstonii的亲缘关系比较密切,同源性高达99%。CandidatusNitrosocaldusyellowstonii是由Torre等从美国黄石国家公园热泉沉积物中富集培养出的一株嗜热硝化古细菌,可以通过好氧氨氧化进行自养生长,并能在高达74℃的热环境中进行硝化作用。氨氧化古细菌的广泛分布和多样性证明其对氮循环的贡献具有全球性意义,但一直以来发现的氨氧化古菌主要分布在中低温环境中,因此该菌株的发现大大地扩展了硝化作用的温度限制,并且证明了氨氧化的能力广泛分布在泉古菌门中。此外,A14-16与CandidatusNitrososphaeragargensis在系统发育树聚为一个分枝(图5)。CandidatusNitrososphaeragargensis是Hatzenpichler等通过富集培养从西伯利亚Garga温泉中获得的一株古细菌,该菌株是第一株被描述的嗜热氨氧化微生物,已在46℃的环境中培养了长达6年的时间。研究表明,该古细菌在中度嗜热的条件下具有较好的氨氧化性能,在0.14和0.79mM氨浓度时活性最高,但在3.08mM氨浓度时部分被抑制。由于该菌的性质非常特殊,所以有学者建议它应该属于除泉古菌界和广古菌界外的另一个新的分类单元Thaumarchaeota。克隆A14-1、A14-10、A14-16和A14-22都与氨氧化作用密切有关,它们在系统发育树上聚为一个大的分枝(图5)。该类序列在样品A14中所占比例高达77.3%。(2)Euryarchaeota广古菌门包括古细菌的大多数种类,在A12文库中所占比例高达62.5%,是该样品中的绝对优势类群,但在A14文库中没有广古菌门类微生物的分布。此外,A12文库中的Euryarchaeota都属于产甲烷鬃毛菌(Methanosaeta),该属微生物是很多厌氧环境中最主要的产甲烷古菌。主要克隆A12-11与MethanosaetathermophilaPT(嗜热甲烷鬃毛菌)的同源性达98%,是亲缘关系最近的已培养菌种。MethanosaetathermophilaPT最早分离自污泥消化反应器,为革兰氏阴性杆菌,专性厌氧,最适生长温度为55～60℃,最适生长pH为7左右,只能利用乙酸进行生长和产甲烷,不能利用H2-CO2、甲酸、甲胺和甲醇进行生长,生长时不需要NaCl。目前,该菌种的全基因组已经获得了测序。3民宿中细菌和古细菌群落的组成第利用分子生物学方法分析两热泉样品中古细菌的多样性,结果表明热泉中古细菌主要分属泉古菌门(Crenarchaeota)和广古菌门(Euryarchaeota)两个门。其中Euryarchaeota是山湾子温泉A12(74.5℃)的优势类群,而Crenarchaeota是七家温泉A14(61.4℃)的优势类群。A14文库的古细菌多样性水平明显比A12高,表明温度是影响温泉中古细菌多样性的重要环境因子。此外,在两文库中还存在少量的未分类的古细菌,这些特殊的微生物类群是认识和研究新型古细菌的良好材料。产甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)在样品A12中占统治地位,所占比例高达62.5%。该属古细菌只能利用乙酸作为碳源生长和产甲烷,它们广泛分布在厌氧环境中,尤其是各类厌氧反应系统中,例如污泥厌氧消化反应器、固体废弃物处理系统、UASB反应器和厌氧折流板反应器等。在厌氧反应器的起始阶段,因为系统中乙酸浓度较高,所以产甲烷鬃毛菌往往具有很高的数量。但像本研究这样,产甲烷鬃毛菌在74.5℃的温泉系统中占统治地位的现象在类似研究中还比较罕见。产生这种特殊现象的主要原因可能是,A12温泉中细菌和古细菌之间形成了一种特殊的共生关系,细菌在源源不断地为产甲烷鬃毛菌提供生长所需要的唯一碳源——乙酸。我们在前期研究中发现,在样品A12的细菌群落中,厌氧芽胞杆菌属(Anoxybacillus)细菌的比例高达93.5%,占绝对统治地位。该属细菌在厌氧条件下可以葡萄糖、果糖、海藻糖和淀粉等多种有机物为底物进行发酵代谢,最主要的发酵产物为乙酸和氢气。此外,样品A12细菌群落的其他成员均为醋弧菌属(Acetivibrio)细菌,该属微生物发酵碳水化合物的主要产物同样也是乙酸。因此,山湾子温泉A12中,细菌和古细菌形成了类似厌氧水处理系统中的产氢产乙酸菌和产甲烷菌的共生关系:细菌主要通过厌氧发酵有机物产生乙酸和氢气,而古细菌主要以细菌产生的乙酸为底物进行生长和产甲烷。正是这种共生关系的存在,才导致产甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)在样品A12中占统治地位。七家温泉A14的古细菌群落和与山湾子温泉A12截然不同,该样品中77.3%的序列与好氧氨氧化作用有关。氨氧化作用是好氧微生物将铵态氮转化为亚硝酸盐氮的过程。作为硝化作用的限速步骤,氨氧化作用在氮素生物地球化学循环过程中一直备受关注。长期以来,人们普遍认为Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria中的好氧化能自养氨氧化细菌是氨氧化作用的主要承担者。然而,随着近年来微生物分子生态学研究的不断深入,人们逐渐发现氨氧化古菌广泛分布在海水、土壤、河口沉积物、珊瑚、海绵以及废水生物反应器等各种自然和人工环境中。在很多条件下,氨氧化古菌的数量要远远高于氨氧化细菌。因此,氨氧化古菌在全球氮素循环中发挥着重要作用。早期人们发现的氨