红豆杉科及相关科植物叶绿体rbcl基因pcr产物的限制酶切分析

红豆杉科及相关科植物叶绿体rbcl基因pcr产物的限制酶切分析

蘑菇科是研究裸子植物系统发育最重要的类群之一。人们为阐明其分类地位和系统关系一直进行着不懈努力,迄今已经在形态学、比较解剖、胚胎发育、孢粉学、化石、植物化学、核型分析和同工酶酶谱等方面积累了许多资料,其中不少是我国学者所做的贡献(桂耀林和胡玉熹,1974;周,姜笑梅,1992;胡玉熹,1984;李莹等,1986;席以珍,1986;朱太平,1979;马忠武等,1985)。但是,有关红豆杉科的一些基本系统学问题至今仍有争议:(1)红豆杉科应包含的成员及其分类方案;(2)红豆杉科、三尖杉科和罗汉松科是否为自然类群以及它们之间的系统关系;(3)红豆杉科在松柏类中的地位。根据现有资料还无法对这些问题作出确切判断。在当前的植物分子系统学研究领域,叶绿体rbcL基因,即核酮糖1,5_双磷酸羧化酶/加氧酶或称Rubisco大亚基基因较为引人瞩目。它应用于植物的系统发育研究具有一些独特的优点:(1)以单拷贝形式存在,不发生基因转变;(2)长达1.4kb,能提供充足的分子性状;(3)进化速率特别适于研究属或属以上分类单位间的系统关系。rbcL基因序列现已被广泛应用于探讨被子植物的系统发育问题,但是在裸子植物方面的应用却很少,只是在杉科和柏科开展了部分尝试性工作(Brunsfeldetal,1994)。本文运用PCR_RFLP方法对红豆杉科、三尖杉科和罗汉松科14种植物的rbcL基因进行分析,并试图探讨三科部分系统学问题。1材料和方法1.1来自来源本实验所用材料分别取自广州华南植物园和中山大学校园(表1)。1.2总dna提取总DNA提取方法采用改进的CTAB法(Suetal,1998)。1.3选择性内切酶TaqDNA聚合酶、dNTP和100bpDNALadder购自GendaTechnologyCorp.Canada;限制性内切酶为NewEnglandBiolabs产品;PCR反应在PerkinElmerCentus公司2400型热循环仪上进行。1.4pcr扩增检测每100μlPCR反应体积中包括:50mmol/LKCl;10mmol/LTris_HCl;1.5mmol/LMgCl2;0.1%TritonX_100;dNTP各0.2mmol;模板用量为50～100ng;2.0单位TaqDNA聚合酶;引物各40pmol;引物1序列为5’ATGTCACCACAAACAGAGACT3’,引物2序列为5’CCTTCATTACGAGCTTGCACAC3’,参考Genbank中南方红豆杉、穗花杉、罗汉松和竹柏的rbcL基因序列(AB027316、L12580、AF249616及AB027314)设计,由中国科学院微生物研究所合成。PCR反应程序为:94℃变性1min,54℃退火2min,72℃延长3min,总计35个循环;末次循环72℃延长10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测其分子量。1.5选择性内切酶实验选用BamHI、BglII、EcoRI、EcoRV、HaeIII、HinfI、MspI、SacI、SphI、XbaI共10种限制性内切酶进行酶切。酶解溶液体积为20μL,内含10μLPCR产物,10单位限制性内切酶和2μL相应的限制性内切酶缓冲液。在适当的温度下(依不同的酶而定)消化2～3小时。1.6琼脂糖凝胶电泳1.5%琼脂糖凝胶1xTAE电泳1.5h(4V/cm),254nm紫外灯下观察、照相(图版1)。1.7限制位点分析根据PCR产物中某一位置切点的有无,以1、0表示,构建数据矩阵。采用PHYLIP(phylogenyinferencepackage)Version3.57c软件包(Felsenstein,J,1993)对限制位点数据进行极大简约法(maximumparsimonymethod)分析,寻找一致树。运用Treeview软件绘制分支图。2抗核酸内切酶基因片段的分析本实验选用BamHI、BglII、EcoRI、EcoRV、HaeIII、HinfI、MspI、SacI、SphI、XbaI共10种限制性核酸内切酶对红豆杉科、三尖杉科及罗汉松科14种代表植物的rbcL基因片段进行了PCR_RFLP分析,发现其中7种内切酶产生29个变异位点,变异位点的分布情况见表2。在此基础上,运用PHYLIP软件包中的应用程序求得步长为6的最简约树18个,图1为其中的代表之一。进一步计算出一致树和一致树中各分支出现的频率(图2)。3讨论3.1穗花杉属热价值红豆杉科(Taxaceae)在我国存有4属:红豆杉属(Taxus)、白豆杉属(Pseudotaxus)、穗花杉属(Amentotaxus)和榧树属(Torreya),它们均属研究裸子植物系统发育的重要材料。对于该科穗花杉属(Amentotaxus)和白豆杉属(Pseudotaxus)系统位置的认识长期以来一直存在明显分歧。穗花杉属是Pilger根据模式种A.argotaenia(Hance)Pilger于1916年建立的。此种最早被作为罗汉松属(Podocarpus)的一个成员,后被移入三尖杉属,最终又独立为穗花杉属。Pilger(1926)根据雄球果的复合性把穗花杉属和三尖杉属归入三尖杉科。但是Kudo(1931)观察雌球果后认为它不应放在三尖杉科而应成立新科穗花杉科(Amentotaxaceae)或是作为红豆杉科的一个亚科或族。Kudo和Yamamoto(1931)随后又建议成立新科穗花杉科。然而Koidzumi(1932)认为这完全是不必要的。他提出穗花杉属和三尖杉属有联系,主张把红豆杉科和三尖杉科置于同一科内,两者均降至亚科地位。Florin(1948,1951)强调三尖杉属和穗花杉属间雌球果和气孔结构上的差异,认为应把穗花杉属从三尖杉科移到红豆杉科。Keng(1969)也认为穗花杉属放在红豆杉科比放在三尖杉科或是独立成科更好,并且指出红豆杉科可能是通过穗花杉属和三尖杉科相联系。席以珍(1986)对穗花杉和云南穗花杉(AmentotaxusyunnanensisLi)花粉外壁的超微结构观察后发现其花粉外壁表面纹饰和内部结构既不同于红豆杉科也区别于三尖杉科,支持将穗花杉属从红豆杉科分离出来建立穗花杉科。管启良等(1993)报道了穗花杉(Amentotaxusargotaenia(Hance)Pilger)雌株和雄株的染色体数目、核型;从染色体数目、随体和次缢痕位置看,认为穗花杉均不同于红豆杉科其它属和三尖杉科,而接近罗汉松科罗汉松属的某些种,赞同将穗花杉属归于罗汉松科。白豆杉属(PseudotaxusCheng)是郑万钧(1947)建立的,为我国裸子植物特有属之一。Florin将之改名为NothotaxusFlorin,现作为白豆杉属的异名。本属仅有白豆杉(Pseudotaxuschienii(Cheng)Cheng)一种。它的胚胎发育类似于红豆杉属(陈祖铿和王伏雄,1978)。花粉形态的研究显示应把白豆杉由红豆杉属中分离出来成为一新属,而且应将白豆杉属上升为白豆杉族(Pseudotaxeae)与红豆杉族并列(席以珍,1986)。对白豆杉主要化学成分的研究发现它含有铁杉树脂醇,此特征成分在红豆杉科其它几个属中均未发现,显示出对进一步探讨白豆杉属在红豆杉科中的系统位置有重要意义(马忠武等,1982)。张君增等(1996)基于白豆杉和红豆杉属的化学成分有很大差别的原因,支持白豆杉属上升成族的观点。本文通过对rbcL基因进行PCR_RFLP分析显示,红豆杉科是一自然的单系群得到有力支持(18个最简约树均显示相同结果),包括红豆杉属、穗花杉属、白豆杉属和榧树属,红豆杉属构成后三者的姊妹群;穗花杉属和白豆杉属以置于红豆杉科内处理为属为宜,不赞同将两属分别独立成科的观点;在红豆杉科内白豆杉属同榧树属的关系密切。汪小全和舒艳群(2000)对叶绿体matK基因序列的系统发育分析结果也表明红豆杉科和三尖杉科均为单系群,白豆杉属与穗花杉属为红豆杉科中两个自然的属。3.2种类型的克氏原螯属和穗花杉属的分布一般认为三尖杉科(Cephalotaxaceae)仅包括三尖杉属(Cephalotaxus)一属。Eichler(1889)曾把该属置于红豆杉科内。Neger(1907)认为三尖杉属的雌球花极为特殊,与红豆杉科区别显著,首次建立三尖杉科,只包括三尖杉属。Pilger(1916;1926)支持Neger建立三尖杉科的观点,可是他基于对雌球花结构的认识又把穗花杉属归入三尖杉科。Florin(1948;1954)根据雌球花和气孔的结构认为三尖杉属和穗花杉属差异显著,应把穗花杉属从三尖杉科中移出。胡玉熹(1984)在光镜与扫描电镜下比较观察了三尖杉属植物叶片构造与叶表面角质层的特征,发现篦子三尖杉(Cephalotaxusoliveri)和三尖杉属的其余种类相比特征独特,建议三尖杉属分为三尖杉组(Sect.Cephalotaxus)和篦子三尖杉组(Sect.Pectinatae)。傅立国(1984)对三尖杉属的分类作了订正,认为三尖杉属宜分为篦子三尖杉组(Sect.PectinataeL.K.Fu)和三尖杉组(Sect.Cephalotaxus)及9个种。对篦子三尖杉的胚胎学研究发现它与三尖杉属的其它种相比有不少共性但是也存在明显差异,赞同将篦子三尖杉在本属中另立一组(李莹等,1986)。席以珍(1993)对三尖杉科的花粉形态及其外壁超微结构进行了研究。三尖杉属各种间花粉的基本特征大体一致。但是篦子三尖杉花粉某些特征和三尖杉属的其余种相比非常特殊,支持在该属中分别成立篦子三尖杉组和三尖杉组的意见。对rbcL基因进行PCR_RFLP分析发现,三尖杉科是单系群,仅包含三尖杉属一属也得到有力支持;篦子三尖杉在三尖杉科内的地位特殊,构成该科其余植物的姊妹群,支持篦子三尖杉独立成组的主张。3.3竹柏属的分类罗汉松属是罗汉松科(Podocarpaceae)中的一个颇为引人注目的类群。Pilger和Melchior将罗汉松属分为8个组。郑万钧在处理中国罗汉松属植物时也将其分为3个组。Quinn(1969)曾综合研究了罗汉松科内属的界限,认为罗汉松属是人为集合,应将其8个组分别上升为属的等级。另外,罗汉松属内的竹柏类植物因叶脉和生殖器官的构造特殊,分类地位和进化也一直存有许多争议。DeLaubenfels(1969)修订罗汉松科时曾将竹柏类独立成属。Page(1988;1990)确认了Nageia属名的合法性并指出竹柏类是极自然的类群。傅德志(1992)进一步主张将竹柏属从罗汉松科中分离出来建立单属新科竹柏科(NageiaceaeD.Z.Fu)。在对rbcL基因PCR_RFLP数据分析得到的分支图中,竹柏、长叶竹柏和罗汉松共同组成一单系群,显示竹柏类植物应保留在罗汉松属内。Chaw等(2000)对线粒体核糖体小亚基RNA序列、细胞核核糖体小亚基RNA基因序列及叶绿体rbcL基因序列联合进行系统发育分析所得结果中显示罗汉松属和竹柏属构成一单系群,叶状枝属(Phyllocladus)为其姊妹群。汪小全和舒艳群(2000)的ma