脾胃湿热证模型的建立

脾胃湿热证模型的建立

采用科学合理的方法建立脾胃湿热综合征动物模型是研究脾胃湿热综合征本质的重要手段之一。目前关于湿热证动物模型的报道较多,但多限于湿阻证和温病湿热方面的研究,也有个别类似脾胃湿热证动物模型的报道,但大多由于理论依据不足,可重复性差,而未得到大家的公认。本实验模拟脾胃湿热证的临床致病因素,在借鉴以往湿热证造模方法的基础上,采用湿热环境加高脂高糖饮食和白酒建立脾胃湿热证动物模型,并采用单因素与复合因素对比的方法探讨该模型的发生机理,现将研究结果报道如下。1材料和方法1.1实验材料1.1.1动物SD雄性大鼠,体质量(200±20)g,清洁级。由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号:奥检证字2003A010。1.1.2样品与饮料的制备清热化湿基本方:白蔻仁10g，川朴12g，黄芩12g，半夏12g,猪苓15g,郁金12g，台乌10g,玄胡12g。中药饮片购于广州中医药大学第一附属医院中药房。白蔻仁、川朴2药后下,其他药加10倍水浸泡1h后煎煮30min,药渣加少量水后煎煮20min,将药液与白蔻仁、川朴混合后再用文火煎煮5min,减压浓缩至1kg/L水煎液,4℃冰箱保存备用。红星二锅头酒(酒精度为55°),北京红星股份有限公司产品;胃泌素(GAS)放免药盒由解放军总医院科技开发中心放免所提供;胃动素(MTL)放免药盒由北京北方生物技术研究所提供。1.1.3实验设备LRH-800-GS人工气候箱为广东省医疗器械厂产品;YC-DZOZ亚都超声加湿器为北京亚都科技股份有限公司产品。1.2实验方法1.2.1各组不同证型的原因实证模型将50只大鼠适应性喂养3d后,随机分为5组:正常对照组、外因湿热证模型组(外因湿热证组)、内因湿热证模型组(内因湿热证组)、内外因湿热证模型组、内外因湿热证防治组,每组10只。1.2.2饲以高脂高糖饮食加白酒正常组普通喂养15d;外因湿热证组前10d普通喂养,后5d放入温度为(32±2)^,相对湿度为95%的人工气候箱;内外因湿热证模型组参考湿热证造模文献方法并加以改进,将大鼠饲以高脂高糖饮食,即在普通饲料喂养的基础上,加用200g/L蜂蜜水自由饮用,且隔日按大鼠体质量灌服油脂10g/kg,并与油脂隔日灌服10mL/kg白酒,共10d,然后放入温度为(32±2)℃,相对湿度为95%的人工气候箱中,共45d;内因湿热证组饲以高脂高糖饮食加白酒,其中油脂与白酒隔日交替,方法同内外因湿热证模型组,共15d;内外因湿热证防治组前10d与内外因湿热证模型组相同,后5d放入人工气候箱中按10g/kg加服清热化湿方。1.3样品采集、样品制备和指标检测1.3.1胃泌素gas、胃动素mtl、胃动素mtl实验结束后,禁食12h,次日用乙醚轻度麻醉,摘取眼球取血后,颈椎脱臼处死,迅速剖腹,分离并沿大弯侧剪开鼠胃,取胃体、胃窦组织粘膜各约0.5cm×0.5cm,取空肠(近十二指肠处)、回肠(中段)、结肠(近乙状结肠处)各约1.0cm长肠组织,放入-80℃冰箱中保存,检测胃肠粘膜胃泌素(GAS)、胃动素(MTL)。1.3.2n-fmo-1活性体系的制备摘眼球取血4mL,其中2mL放入空塑料管中,离心,取血清密封后,置于-80℃冰箱保存;2mL放入含有100g/LEDTA二钠(乙二胺四乙酸二钠)30μL和抑肽酶30μL的塑料管中混匀,4℃离心,取血浆置于-80℃冰箱保存待测。胃肠组织未融化前,称取组织块0.2～0.4g,放于盛有1mL生理盐水的试管中,然后在90℃水浴箱中水浴5min,冷却后移入玻璃匀浆器中研磨,制成匀浆,倾回同一试管中,另取1mL生理盐水冲洗研磨器,也并入同一试管中,4℃高速离心(3500r/min)10min,分离上清液,放入-80X℃冰箱中保存备用。1.3.3检测方法及仪器血清胃泌素、血浆胃动素及胃肠组织胃泌素、胃动素检测均采用放射免疫测定方法,检测仪器为上海日环厂SN-695B型放免丫测量仪。根据组织样品浓度,计算每0.2g组织粘膜中各种胃肠激素的含量。1.4观察指标的确定根据脾胃湿热证的临床特点及动物症状辨别的可行性,确定以大鼠外观、精神状态及食量、体重、肛温、粪便性状为观察指标。检测大鼠血液及胃肠组织中胃泌素及胃动素含量,以了解大鼠胃肠消化、吸收及运动功能。2结果与分析2.1不同模型大鼠前体及内体的变化,大鼠幼血压、干、软、充外因湿热证组前10d大鼠体质量逐日增加,活动正常,食欲良好,大便正常,后5d放入气候箱中以后,食量及饮水量减少,体质量增长缓慢,烦躁不安,呼吸粗重,毛发疏松粗糙,阴囊松驰下垂,大便不成形或稀便,肛温变化不明显;内因湿热证组大鼠前期体质量增长较快,后期逐渐变缓,精神正常,纳呆少饮,嗜睡懒动,大便或干或软,肛温波动较大;内外因湿热证模型组大鼠前10d体质量增加,粪便时干时软,后5d放入气候箱中以后,食量减少,体质量减轻,精神萎靡,嗜卧懒动,毛发疏松粗糙,晦暗无光泽,大便时干时溏,肛温稍有增加,与其他组相比无统计学差异;内外因湿热证防治组大鼠在放入气候箱中以后与模型组相比,食量增加,体质量缓慢增长,精神似有所好转,大便稀溏减少,肛温无变化。2.2中药对gas水平的影响表1结果显示,内外湿热因素不同程度地使大鼠血清GAS水平上升,清热化湿中药可使血清GAS水平呈一定程度的下降。外部湿热环境可使大鼠血浆MTL水平上升,给予高糖高脂饮食后大鼠血浆MTL水平下降,同时施加两种因素的模型组大鼠MTL水平下降明显,而服用清热化湿方可一定程度地促进MTL分泌。2.3对结肠gas表达的影响表2结果显示,外部湿热环境和内部湿热饮食对胃肠组织各部分GAS水平的影响与正常组相比差异无显著性,而内外因湿热证模型组大鼠综合施加两种因素后,结肠组织GAS水平下降,应用清热化湿方可以良性调节胃肠组织GAS水平,其中对结肠的调节效果最好,与内外因湿热证模型组相比具有显著性意义(P<0.05)。2.4对大鼠肠组织mtl表达的影响表3结果显示,外部湿热环境对大鼠的胃肠组织MTL水平影响较大,内部湿热饮食对大鼠胃肠组织MTL水平的影响与外部湿热环境一致,但无统计学差异,很可能是胃肠运动的紊乱所致。内外因湿热证模型组大鼠胃组织MTL水平变化不大,肠组织MTL水平呈上升的趋势(与正常组相比P<0.01)。应用清热化湿中药可降低结肠组织MTL水平(P<0.05)。3对传统的对证模型的表达脾胃湿热证属于湿热证的一个特殊类型,在动物模型研制思路方面可以互相借鉴。采用“气候因素+肥甘饮食+生物因子”的湿热证造模方法是一个较成熟的造模方案,但该造模方法有些方面还有待进一步完善和提高。如在施加因素上应尽可能地模拟中医传统病因,病理改变上尽可能地体现脾胃功能的失调等;在模型制作过程中,应合理地控制施加因素的作用时间和作用强度,如过强虽有表现但并不一定是病因相关之症,过弱则或无表现,或撤除施加因素后自然恢复过快;在症状上要制定符合动物特征的统一的脾胃湿热证诊断标准,且应有别于脾虚证和其他湿热证动物模型;在客观指标的确立上应根据中医理论选择与脾胃湿热相关性更高、特异性更强的实验指标,在反证药物的选择上要力求标准化,根据药证相关理论,筛选出最能体现脾胃湿热的中药或组方。本研究借鉴其他湿热模型的造模方法,立足于脾胃湿热证的病因与发病学,制定出湿热环境+高脂高糖饮食+白酒的造模方法。3.1关于脾胃湿热综合征的模型研究3.1.1外湿或温湿度外部湿热可以造成脾胃功能的失调,脾为湿脏,喜燥恶湿,胃为燥腑,喜湿恶燥,决定了脾胃对湿热之邪的易感性。张六通等模拟自然发病环境,通过控制气候箱的温度及湿度研究外湿致病机理,结果湿热组出现纳呆少饮,消瘦,大便不成形或稀便,胃肠粘膜糜烂,小肠绒毛上皮变性、坏死、脱落以及炎细胞浸润等消化系统症状。所以通过人工气候箱模拟湿热环境是脾胃湿热证动物模型的一个关键因素,参考有关外湿或湿热动物模型的文献报导,其中关于温度和湿度的设定不尽相同。我们通过设定不同温度和湿度对大鼠死亡率、外观表现及胃肠组织病理变化观察,认为将人工气候箱温度控制在(32±2)℃,相对湿度为95%比较符合脾胃湿热证动物模型的要求。3.1.2饮食中内蕴发热《素问·奇病论》说:“肥者令人内热”,脾胃湿热病人多属膏粱之体,饮食停聚居多,膏粱厚味的食物容易内蕴发热。《脾胃论》云:“饮食失节,甘肥过度,脾胃乃伤”,而脾胃虚弱是湿热发病的前提条件。对实验大鼠给予高脂高糖饮食,一方面可以使大鼠在短期内体质量增加,另一方面长时间给予高脂高糖饮食,可造成大鼠脾胃功能损伤,为脾胃湿热的形成提供了前提条件。3.1.3酒与现实关联,酒以和酒为中心的热价研究中医认为,酒味辛甘,其性温热,具有通血脉、祛寒气、行药势之功。过量及长期饮酒对人体的损伤很大,《证治准绳》云“夫酒者,气味俱能生湿热”。《金匮翼》记载“有饮食之湿,酒水乳酪之类也”。临床研究表明,嗜烟酒者与湿热证关系密切。古代文献关于酒与湿热发病的记载和现代医家关于湿热证发病的流行病学调查表明,酒与脾胃湿热证的发病关系密切。在脾胃湿热证动物模型中,将白酒作为湿热邪气,既符合脾胃湿热证临床发病规律,也与脾胃湿热证中脾胃功能失调表现突出而外感发热的证候较轻的特点相一致。3.1.4对临床表现的表现脾胃湿热证的临床表现较为复杂,广州中医药大学脾胃研究所制定了自己的标准,其主症为:(1)舌苔黄腻;(2)胸闷;(3)胃脘痞满或胀;(4)食欲不振。次症为:(1)口苦而粘;(2)口渴少饮或喜热饮;(3)大便溏,或有粘液;(4)恶心;(5)身困乏力;(6)脉濡缓。因其中大部分为主观症状,无法转换为可供观察的体征,动物模型丢失了许多信息。作为证的重要体征——舌象和脉象也很难观察,不得不加以割舍。这样一来,在脾胃湿热证动物模型中表现出来的可供利用的症状和体征实在太少。我们根据脾胃湿热证的诊断标准和临床特征性变化,选择以大鼠食量、肛温、体质量及外观表现作为观察指标,并尝试选择了胃肠激素(胃泌素、胃动素)来体现脾胃湿热证胃肠功能紊乱导致胃脘痞满、腹胀、恶心等一些主观症状。3.2对脾胃湿热综合征的动物模型的评价3.2.1体质量变化的观察本研究在整个实验过程中,实验大鼠的食量逐渐下降,放入气候箱中以后食量下降更为明显,为了动态观察其体质量变化,将5d作为1个时段,其体质量在实验前2个时段增加,第3时段下降,符合肥胖之人易发生脾胃湿热证的发病规律,模拟了临床实际中脾胃湿热证患者嗜食肥甘,形体肥胖的发病条件。外观表现为造模后期体质量下降,精神萎靡,嗜卧懒动,毛发疏松粗糙,晦暗无光泽,大便时干时溏。3.2.2不同模型组胃肠激素水平上升和下降的趋势血清及胃窦部组织GAS水平上升,各段肠组织GAS水平有下降的趋势。血浆MTL下降,而各段肠组织MTL水平有上升的趋势。与外因湿热证组和内因湿热证组相比,内外因湿热证模型组胃肠激素水平上升与下降趋势不尽相同甚至相反,并不是两种因素造成结果的简单叠加或相互抵消。胃泌素及胃动素水平的升高或降低,在一定程度上反映了胃肠消化、吸收、排泄功能障碍和蠕动节律的紊乱,与临床脾胃湿热证患者多表现为胃脘部痞满或胀痛,泛酸、纳呆等胃肠症状相一致。3.2.3治泻热证的制备清热化湿基本方是劳绍贤教授在长期临床诊疗过程中总结出的治疗脾胃湿热证的经验方。清热化湿方药物组成为白蔻仁、黄芩、厚朴、半夏、猪苓、郁金、乌药等。劳教授认为,脾胃湿热证系脾失健运,湿浊内生,蕴而化热而成,其治疗宜用芳香化湿之品以通达气机,清热化湿中宜重祛湿。清热化湿方由多种清热化湿中药组成,应用于临床脾胃湿热证患者取得了良好的效果