空气悬浮法制备长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌二联活菌微胶囊的研究

空气悬浮法制备长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌二联活菌微胶囊的研究

目前，许多微生态活动器都存在两个问题：一是服用经过加工的活动器，其活性物质不耐胃酸、胆褐色素和消化酶，因此很容易失去活力。双螺线菌和其他厌氧菌容易受到外部环境因素（如氧气和温度）的影响，耐低温，需要在低温下储存和销售，这使得这些产品的生产、销售和应用变差。目前微胶囊技术是保护菌体活力最有效和实用的方法,该技术是利用天然或合成的高分子材料,将固体、液体甚至是气体的微小颗粒包裹在直径从小于1μm至5000μm的半透性或密封囊膜的微型胶囊内。由于微胶囊内的物质与外界隔离,可免受外界不利环境的影响,若采用肠溶性囊材,还可避免口服时胃液的破坏。空气悬浮法(又称流化床法)制备微胶囊,是将固体囊心物悬浮于由流化床产生的承载气流中,呈沸腾状。囊液由喷嘴喷出,雾化形成微液滴,在囊室与悬浮的囊心物相遇,液滴在囊心物表面铺展并相互结合。由于气体的不断流动,溶解囊材的有机溶剂迅速挥发,聚合物在囊心物表面形成囊衣。被包囊的颗粒随气流在囊室循环,完成包囊与固化过程。本研究将空气悬浮微胶囊技术应用于微生态制剂,将长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、保护剂和双歧因子包封于肠溶囊膜内,制成长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌二联活菌制剂,以期提高口服时的菌体存活率和常温下的保存期。1材料表面1.1菌株的覆盖和保藏中心长双歧杆菌(Bifitdobacteriumlongum,简称BL,CICC6068)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus,简称LA,CICC6005):购自中国工业微生物菌种保藏中心。1.2cacl2-meso4的制备长双歧杆菌:大豆蛋白胨0.5g,胰蛋白胨0.5g,酵母粉1.0g,葡萄糖1.0g,低聚木糖0.5g,无机盐溶液4mL,蒸馏水100mL,盐酸半胱氨酸0.05g(培养基热沸后加入),调pH7.0,121℃灭菌15min。固体斜面加琼脂1.5～2.0g。上述无机盐溶液:CaCl20.2g,MgSO4·7H2O0.48g,K2HPO41.0g,KH2PO41.0g,NaHCO310g,NaCl2g。混合CaCl2和MgSO4在300mL蒸馏水中溶解,加蒸馏水500mL,边搅拌边缓慢加入其它盐类至溶解,加蒸馏水200mL混匀。嗜酸乳杆菌:蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母膏5g,柠檬酸氢二铵2g,葡萄糖20g,吐温801mL,CH3COONa·3H2O5g,K2HPO4·3H2O2g,MgSO4·7H2O0.58g,MnSO4·H2O0.25g,蒸馏水1000mL,调pH6.2～6.4,121℃灭菌15min。固体斜面加琼脂15～18g。1.3脱脂乳粉m海藻糖:纯度>99%(日本林原商事);透明质酸(HA):Mr=2.0×106,批号20040516(山东福瑞达生物化工);脱脂乳粉(黑龙江完达山乳业);聚丙烯酸树脂Ⅱ(泰安明天化工)。1.4干机、湿机、水热机YQX-II厌氧培养箱(上海新苗医疗器械公司);FreeZone6L冷冻干燥机(美国Labconco公司);CR20B2高速冷冻离心机(日本HITACHI公司);流化床包衣机(沈阳药科大学提供);SPX-150恒温培养箱(北京市永光明医疗仪器厂);S-520扫描电子显微镜(日本HITACHI公司)。2方法2.1保护剂的配制长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌菌种分别活化,接种,37℃培养20h,于4℃、5000r/min离心10min收集菌体,湿菌体与保护剂和双歧杆菌增生促进剂低聚木糖溶液混和均匀,得菌悬液,冷冻干燥得冻干菌粉。冻干菌粉磨碎、筛分,将长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌2种菌粉等量混合,备用。保护剂的配方及其与菌泥的比例为:10%海藻糖、0.6%HA和20%脱脂乳粉(长双歧杆菌)或10%海藻糖、0.2%HA和10%脱脂奶粉(嗜酸乳杆菌)分别以1:1:1的体积比复配后,再与菌泥以3:1的比例混合。低聚木糖的最后浓度为0.5%,无保护剂组用磷酸盐缓冲液代替保护剂。2.2减少感染计数样品经适当稀释后涂布于固体培养基上,每个稀释度做4个重复,37℃厌氧培养20h后菌落计数。2.3样品袋的制备称取适量聚丙烯酸树脂Ⅱ,缓慢加入不断搅拌的95%乙醇溶液中,避免结块,继续搅拌至完全溶解,加入适量辅料,混匀备用。2.4空气流量调节称取一次处理量的菌粉置于流化床上,调节适当的空气流量,使菌粉呈沸腾状;调节温度、流速和雾化压力,使囊液呈细小的液滴喷出。喷出的囊液与呈沸腾状的菌粉相遇,制得微胶囊。2.5总ph及胰酶液制备人工胃液:取稀盐酸16.4mL,加水约800mL及胃蛋白酶10g,搅匀后加水定容至1000mL即得。人工肠液:取磷酸二氢钾6.8g,加水500mL。用0.4%氢氧化钠溶液调节pH至6.8;另取胰酶10g,加水适量使溶解。将两液混合后,加水定容至1000mL即得。人工胃液和人工肠液均采用0.2μm无菌微孔滤膜过滤除菌。2.6不同转速时相同转速的透光率测定取微胶囊1g,置于盛有50mL人工胃液(pH1.2)的三角瓶中,再置于(37±0.5)℃恒温、转速为150r/min的摇床上,分别于0,20,40,60,80,100,120min时取样,测定其在600nm的透光率。另将经上述处理的微胶囊离心取沉淀,用人工肠液解囊,适当稀释后活菌计数,根据透光率和微胶囊内活菌数变化分析人工胃液中微胶囊的溶出情况。2.7摇床透光率测定取微胶囊1g,置于盛有50mL人工肠液(pH6.8)的三角瓶中,再置于(37±0.5)℃恒温、转速为150r/min的摇床上,分别于0,10,20,30,40,50min时取样,测定其在600nm的透光率。另将经上述处理的微胶囊,适当稀释后活菌计数,根据透光率和微胶囊内活菌数变化分析人工肠液中微胶囊的崩解情况。2.8试验因素及指标分析以微囊增重、增塑剂邻苯二甲酸二乙酯(di-ethylphthalate,DEP)用量和润滑剂硬酯酸镁用量为试验因素,以微胶囊在人工肠液中的崩解时间为主要指标,以微胶囊耐酸性(以在人工胃液中处理2h后菌存活率表示)为参考指标。正交试验因素水平见表1。2.9微胶囊中的活菌数测定产品中活菌数的测定:取微胶囊1g左右,置于50mL人工肠液中,按2.7所述方法处理45min,适当稀释后活菌计数。加入的活菌数测定:根据微胶囊较菌粉增重计算,取与1g微胶囊相当的菌粉,适当稀释后活菌计数。微胶囊中的活菌数=产品中的活菌数-微胶囊表面的活菌数微胶囊表面的活菌数测定:取微胶囊1g左右,置于50mL、pH5.0的磷酸盐缓冲液中,按2.6所述方法处理45min,适当稀释后活菌计数。包囊产率=微胶囊中的活菌数/加入的活菌数×100%包囊效率=微胶囊中的活菌数/产品中的活菌数×100%2.10干燥器稳定性测定样品装在无菌敞口小瓶内,小瓶置于干燥器中,用饱和亚硝酸钠溶液调节干燥器内相对湿度为60%～65%,干燥器于37℃恒温培养箱中贮存3个月,每月测定剩余活菌数,同时以冻干菌粉作对比实验。3结果与分析3.1温度对膜结构的影响影响空气悬浮微胶囊化效果的因素主要有:雾化压力、喷液速度、空气流量、进风温度和物料处理量等。包衣时喷雾液滴的直径应小于被包囊心,喷雾液滴的大小是喷液速度和雾化压力综合作用的结果。在恒定的雾化压力下,加大喷液速度使液滴变大;在恒定的喷液速度下,加大雾化压力液滴变小。不论何种原因引起的液滴粒径变大都会增加粒子粘连的趋势。包衣前首先要进行喷雾测试,检查喷雾状态是否连续均匀。包囊微粒时,因包衣增重大,在不发生粘连的前提下,应尽量加大喷液速度,以缩短包衣时间。温度对膜结构的影响与成膜材料、溶剂、增塑剂种类及包囊物的理化性质有关。进风温度的选择是以有机溶剂尽快挥发又不至于使菌体失活为原则。一般用有机溶剂的囊液操作温度应低于水分散体的系统。温度过高造成菌体失活,且衣膜干燥过速,易产生气泡,表面粗糙;温度过低,溶剂蒸发太慢,会引起包囊物粘结。空气流量的大小决定物料通过包衣区的速度和物料的流化状态,因而该参数影响干燥效率和包衣均匀性。若气流太高,会使菌粉流化时剧烈沸腾,不利于囊心物与囊液液滴充分地接触;气流过低,菌粉不能达到沸腾状态,使循环包衣失败。要通过实验确定合适的空气流量,既防止物料过多地吸附于柱筒壁上,又保证物料充分流化。物料处理量是保证微囊化时批次间重现性的重要参数。当物料量增加时,为达到理想的流化效果,需要增加进风量,同时喷液速度及雾化压力都要进行相应的调整,即物料处理量与其它微囊化操作条件是相对应的。因此为得到稳定的产品,每次的物料处理量应一致。综合考虑上述因素,经过反复实验,确定流化床微胶囊化操作条件为:雾化压力0.2MPa;空气流量10～12m3/min;流化床进气温度35～45℃;囊液流速1mL/min;物料处理量5～10g。3.2混悬液成膜效果囊液浓度对喷雾性能产生重要影响。以95%乙醇为溶剂,比较6%,8%,10%3种浓度的聚丙烯酸树脂Ⅱ,发现6%囊液黏度小,喷射时呈雾区高,单位体积囊材少,溶剂蒸发较慢;10%囊液黏度过大,不容易被分散,液滴大且易阻塞喷嘴,增大气流量时破坏囊心物的流化;而8%囊液黏度适中,成膜效果好,溶剂蒸发速度适当,粘结现象少。因此本研究所用囊液为以95%乙醇为溶剂的8%聚丙烯酸树脂Ⅱ。3.3增塑剂和润滑的用量制备微胶囊时,囊液的用量与囊心物的表面积有密切的关系。囊心物越细小,其比表面积越大,则囊材用量也越大。由于本研究采用的囊心物为冻干菌粉,形状不规则,无法将其近似为球体来计算表面积,故可由最后产品增重来确定囊液的用量。高聚物作为囊材,单独应用形成的薄膜在温度降低后,物理性质发生变化,囊膜变得硬而脆,容易破裂。为改进囊膜质量,常在囊液处方中添加增塑剂。润滑剂的作用是有助于粒子充分流化,减少粒子间粘连。增塑剂和润滑剂的用量通过正交试验确定,结果如表2、3。正交试验3个因素对微胶囊在人工肠液中崩解性的影响顺序是:微囊增重>硬酯酸镁用量>DEP用量,最佳组合为:A1B1C3或A2B1C3。根据菌体在人工胃液中的存活率,最终选择A2B1C3,即微胶囊较菌粉增重20%,DEP用量10%,硬酯酸镁用量1.5%。3.4菌粉和微胶囊的活菌数及存活率将冻干菌粉和微胶囊分别置于人工胃液中处理,于2h后取样,用无菌水将胶囊颗粒清洗2次,再放入人工肠液中进行崩解,测经人工胃液处理2h后囊中的活菌数。菌粉和微胶囊中的活菌数及存活率比较见表4。微囊化菌粉在人工胃液中处理2h后,存活率达到54.08%,而冻干粉的存活率仅为十万分之一,表明直接服用冻干菌粉不能保证足够量的活菌进入肠道,制备成肠溶性微胶囊后,其耐酸性显著提高。微胶囊经人工胃液处理40min后,发生浑浊,透光率降低,表明有部分微胶囊因包囊不完全而发生渗漏,见图1。40min后继续处理至2h,透光率基本稳定,表明微胶囊在人工胃液中基本不发生泄漏,耐酸性良好。3.5不同浓度人工肠液微胶囊的变化见表5。微胶囊在人工肠液中逐渐溶解,处理至30min时,透光率降至最低值,且人工肠液中未见固体颗粒,30min后透光率和释放率基本稳定,表明微胶囊已完全崩解,见图2。由此判断,该法制备的微胶囊具有良好的肠溶性。3.6收菌数的确定测得微胶囊产品中的活菌数为9.56×109CFU/g,微胶囊表面的活菌数为1.2×109CFU/g,则微胶囊中的活菌数=9.56×109–1.2×109=8.36×109(CFU/g)。根据微胶囊较菌粉增重20%计算,每1g微囊含菌粉0.83g,因此加入的活菌数为1.48×1010CFU/g微囊。包囊产率=8.36×109/1.48×1010=56.49%,包囊效率=8.36×109/9.56×109=87.45%。3.7加保护剂对菌粉微囊化的影响将添加保护剂与未加保护剂的冻干菌粉分别制成微胶囊,再与冻干菌粉进行比较,活菌变化结果如表6。微胶囊和菌粉在恒温37℃、相对湿度60%～65%条件下贮存3个月后,发现菌粉吸水,粘连成团,颜色变深;微胶囊形态、颜色均无变化。贮存期间活菌数均逐步降低,菌粉微囊化后存活率显著提高