第2章 细胞生物学技术

第二章细胞生物学技术细胞形态结构的观察方法细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术§1细胞形态结构的观察方法

光学显微镜技术

电子显微镜技术

扫描隧道显微镜光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。1.构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。（一）普通光学显微镜1.物镜转换器2.接物镜3.游标卡尺4.载物台5.聚光器6.彩虹光阑7.光源8.镜座9.电源开关10.光源滑动变阻器11.粗调螺12.微调螺旋13.镜臂14.镜筒15.目镜16.标本移动螺旋3.分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。分辨距离越小，则分辨能力越高。R=0.61λ/N．A．λ为入射光线波长；N．A．（镜口率）

＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。思考：如何提高显微镜的分辨能力？N·A：显微镜物镜的镜口率—光学性能指标，每个物镜上都标有其镜口率的数值）。几种介质的折射率物镜镜口率受入射镜口角和介质折射率的限制，不可能有更大提高。所以科学家们从另外两个途径来改进显微镜：换用短波长的“照明光源”，来提高分辨能力。如：紫外光显微镜，电子显微镜。应用特殊光学效应，增强反差，来提高分辨能力。（二）荧光显微镜

Fluorescencemicroscope特点：光源为紫外线，波长较短，分辨能力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。（二）荧光显微镜

Fluorescencemicroscope原理：以紫外光为光源，使被检材料中的荧光物质激发出荧光，从而对细胞内某些物质进行定性和定位分析。荧光现象有两种：（１）自发荧光：细胞内某些天然荧光物质被紫外光照射所激发的荧光，例如叶绿素（血红色自发荧光）；（２）诱发荧光：在细胞中加入荧光染料（荧光素），与细胞内某种特定成分结合在一起，经紫外光照射激发出荧光。例：荧光染料吖啶橙，可使RNA发出红色荧光，而使DNA发出绿色荧光。荧光显微镜与普通光镜在结构上不同之处：（1）紫外光发生装置：高压汞灯+激发装置+滤光装置；（2）透镜由石英玻璃制成，以便减少光通路上的紫外光损耗；（3）目镜中要装压紫滤片Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。（三）相差显微镜原理：

光波的三个光学特性：（1）波长：对于光波波长变化，肉眼觉察为颜色变化;（2）振幅：对于光波振幅变化（即振幅差），肉眼觉察为明暗变化；（3）相位：指某一时刻，光在其前进路线上的位置。对于光相位的变化（即相位差），肉眼不能觉察。当光线穿过无色透明且非匀质的活细胞，其波长和振幅都无明显变化，仅光相位出现一定程度变化。观察时感觉反差较小，物体内部的结构难分辨。为何普通光镜不适宜用于观察活细胞？把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度。在构造上，相差显微镜的两个特殊之处。环形光阑（annulardiaphragm）：位于光源与聚光器之间。作用：使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上。相差板（annularphaseplate）：物镜后加了涂有氟化镁的相差板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。相差显微镜原理相差显微镜却是运用一些特殊装置，使通过被检物体的光线分离成两组光波，并人为地使这两组光波之间微弱的相位差加大，再经过光波干涉作用，使看不见的相位差转变成可见的振幅差，从而反差增强，便能够清晰看到被检物体及其内部细微结构了。相差显微镜下的样品不需染色，可以清晰观察活细胞及其内部结构的变化。相差显微镜用途：观察未经染色的玻片标本二、电子显微镜（一）透射电子显微镜transmissionelectronmicroscope,TEM不同光线的波长以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。由电子束照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统等４部分构成。分辨率0.2nm，放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2µm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopicstructures）。（1）照明光源不同。（2）放大倍数的调节方式不同。依靠改变磁透镜的激磁电流强度来调节放大倍数。电流强度的变化引起了磁场强度的改变，而磁场强度的变化又使电子射线的折射程度发生改变，放大倍数随之出现变化。（3）具有高压稳压系统。电子流的发射速度及波长皆取决于电压的高低。透射电子显微镜特点（4）高度真空的工作系统。高速运动的电子流如果与空气中的微粒和分子碰撞，就会改变它的发射方向，导致成像模糊。要求电镜内的工作系统（包括样品室）都必须保持高度真空状态，并且样品都必须脱水。因此说，透射电镜不能用来观察活的样品。透射电子显微镜特点（5）样品厚度必须<900Å（即90nm，0.09μm）。

电子穿透能力有限，样品过厚则成像不清晰，并且高速穿透的电子会产生热量，将厚样品烧出白斑。透射电镜观察的样品须超薄切片（400-500Å），不能用普通光镜下的组织切片（2-7μm）。

透射电子显微镜特点（6）标本染色技术不同。电镜标本染色是使须观察的结构与背景之间，黑白对比分明，反差强。染色剂大多是重金属盐类。染色方法有正染、负染两类。正染：常采用醋酸铀或柠檬酸铅染色，使得被观察的结构偏暗，背景较亮。负染：使用磷钨酸染色，使得背景较暗，而观察的结构显得明亮突出。透射电子显微镜特点（7）特殊的投影技术（真空喷镀法）。

对电镜标本的表面处理技术，即以真空喷镀仪在真空条件下，将金、铂等金属微粒倾斜地喷向标本，使其朝向发射源的表面所沉积的金属微粒多于背面。电镜观察时感觉反差极强，具立体感。透射电子显微镜特点主要电镜制样技术1）超薄切片电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。超薄切片技术2）负染技术用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色。吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸出的地方没有染料沉积，从而出现负染效果。分辨率可达1.5nm左右。NegativeStainedActin主要电镜制样技术3）冰冻蚀刻

freeze-etching标本置于干冰或液氮中冰冻，然后断开。升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。AYeastCell主要电镜制样技术20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。（二）扫描电子显微镜工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。扫描电子显微镜原理人类红细胞酵母人类精子（三）扫描隧道显微镜

scanningtunnelingmicroscope，STM原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。扫描隧道显微镜原理一、离心技术分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。高速离心机:转速为10~25kr/min。超速离心机:转速>25kr/min。第二节细胞组分的分析方法（一）差速离心

Differentialcentrifugation特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序细胞核——线粒体——溶酶体、过氧化物酶体——微体、高尔基体、囊泡——核蛋白体。细胞器初步分离后，再通过密度梯度离心纯化。（一）差速离心

Differentialcentrifugation（二）密度梯度离心用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。1、速度沉降

velocitysedimentation

用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特点：介质密度较低。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降。2.等密度沉降

isopycnicsedimentation用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度较高，陡度大。原理：样品各成分在连续梯度的介质中，经过离心，沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡。Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation二、细胞成分的细胞化学显示方法显色剂能与待测物质中一些特殊基团特异性结合。通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅，判断某种物质在细胞中的分布和相对含量。孚尔根反应：特异显示DNAPAS反应：多糖米伦反应：蛋白质四氧化锇、苏丹红：不饱和脂肪酸、脂滴