第四章 发酵工程及酶工程

微生物与发酵工程微生物的类群无细胞结构：病毒有细胞结构真核生物微生物细菌放线菌蓝藻支原体衣原体立克次氏体等真菌：霉菌、酵母菌、食用真菌原生生物：显微藻类、原生动物等原核生物第一节原核微生物一、细菌1、形态球状杆状螺旋状基本形态还有星形和方形细菌细菌的结构拟核质粒含有抗药性基因、固氮基因、抗生素生成基因

细菌DNA2、细菌的繁殖——二分裂少数进行接合生殖，但频率极低细菌的二分裂3、菌落菌落：肉眼可见具有一定形态结构的子细胞群体

不同细菌的菌落具有不同特征，表现在菌落的大小、形状、光泽度、颜色、硬度透明度等方面。菌落特征是鉴别菌种的主要依据。菌落有鞭毛细菌：大而扁平，边缘成波状或锯齿状。无鞭毛细菌：较小较厚，边缘整齐。有荚膜细菌：菌落光滑。S型无荚膜细菌：菌落粗糙。R型二、放线菌：放线菌的形态单细胞，菌体由菌丝构成放线菌是具有菌丝、以孢子进行繁殖的一类原核微生物。放线菌分布特点及与人类的关系放线菌常以孢子或菌丝状态极其广泛地存在于自然界，土壤中最多，其代谢产物使土壤具有特殊的泥腥味。能产生大量的、种类繁多的抗生素（其中90%由链霉菌产生）除青霉素和头孢霉素等少数抗生素少数寄生型放线菌可引起人、动物（如皮肤、脑、肺和脚部感染）的疾病。繁殖：孢子生殖、孢子囊孢子、菌丝断裂营养方式：腐生、寄生三、支原体：无细胞壁、最小的原核生物例：人的非典型性肺炎特点：能过细菌滤器；膜上含甾醇；对青霉素、制霉菌素、红霉素、四环素敏感；革兰氏阴性菌、无芽孢、无鞭毛；菌落呈油煎蛋形繁殖：二分裂，少数菌丝断裂或出芽四、古生菌：原核生物包括：极端嗜盐、嗜热、嗜酸细菌和产甲烷细菌等细胞壁：有假肽聚糖、糖蛋白或蛋白质构成细胞膜：1、膜中的亲水头与疏水尾通过醚键连接2、疏水尾是由异戊二烯的重复单位组成3、存在单分子层膜或单、双分子层混合膜繁殖：裂殖、芽殖第二节真核微生物

（真菌、微细藻类、原生动物）1、特点：具核膜；具线粒体、叶绿体等细胞器；能进行有丝分裂2、营养方式为异养。真菌无光合色素，异养方式复杂多样。营腐生、寄生（专性寄生、专性腐生、兼性寄生、兼性腐生、先寄生后腐生——寄主死亡所致）或共生。3、无性生殖和有性生殖：4、具有细胞壁（绝大多数含有几丁质。也有的含纤维素和葡萄糖。黏菌的营养体无细胞壁但孢子具有壁；5、营养体为单细胞或丝状（具有单细胞真核结构的真菌，如酵母菌属；具有无隔多细胞核多分支菌丝结构的真菌，如水霉属；具有有隔有细胞核有分支菌丝结构的真菌，如子囊菌）等。酵母菌单细胞真菌结构繁殖霉菌无隔菌丝（毛霉、根霉）有隔菌丝（青霉、曲霉）细胞壁结构：三层繁殖方式：无性、有性

葡聚糖糖蛋白+葡聚糖几丁质微纤维第三节病毒和亚病毒病毒界主要类群及其相互关系是：病毒（真病毒）病毒界朊病毒(蛋白质侵染颗粒）亚病毒拟病毒（类类病毒）也称’病毒卫星’(单链RNA)

类病毒（马铃薯纺锤体块茎病单链环状RNA）SARS病毒、禽流感病毒、典型病毒粒的构造基本成分核酸——位于中心，称为核心蛋白质——包围在核心周围，形成衣壳核心和衣壳合称核衣壳，为病毒的基本结构。有些复杂的病毒在衣壳的外面包裹着一层由脂类、蛋白质和多糖组成的囊膜。有的囊膜上还长有刺突。病毒病毒粒子并无个体的生长过程，而只有其两种基本成分的合成和装配，即：核酸复制+蛋白质合成

核蛋白（病毒粒子）噬菌体的增殖一般可分五个阶段，即吸附注入核酸合成核酸和蛋白质装配释放病毒繁殖方式：复制增殖艾滋病毒侵染朊病毒（蛋白质病毒）朊病毒（Prion）：存在于正常脑神经细胞中称为细胞型粒子蛋白（PrPc

）。正常的PrPc

螺旋，在致病的PrPsc变成折叠结构。并且不溶于水，能抗蛋白酶的水解。感染性蛋白粒子。（羊搔痒病、疯牛病、人的库鲁病、克雅氏病）类病毒：只有裸露的RNA，没有蛋白质外壳。(马铃薯纺锤形块茎病）一、营养物质及其生理功能微生物所需的五大类营养物质及功能第四节微生物的营养（非病毒）微生物生长需要的物质——营养要素碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水碳源CO2、碳酸盐含碳有机物天然物质：花生粉饼、石油最常用是糖类小分子有机物蓝细菌、硝化细菌等自养微生物红螺菌等异养微生物（甲烷和甲醇）甲烷氧化菌大多数异养微生物合成微生物的细胞物质和一些代谢产物；主要能源物质（异养微生物）氮源分子态氮铵盐、硝酸盐有机物：尿素、牛肉膏、蛋白胨异养微生物（供能）固氮微生物合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物最常用的氮源无机物氨能源有机碳：化能异养微生物NH4+、NO2-、S、H2、Fe2+(化能自养微生物）光能：光合细菌无机盐构成微生物细胞组成作为酶的组成成分调节和维持细胞的渗透压作能源微生物种类生长因子需要量肠膜乳状杆菌胱氨酸5μg白喉棒杆菌β-丙氨酸1.5μg破伤风梭状芽孢杆菌尿嘧啶0-4μg阿拉伯聚糖乳杆菌泛酸0.02μg粪链球菌叶酸200μg干酪乳杆菌生物素1μg几种微生物所需的生长因子生长因子：微生物生长不可缺少的微量有机物种类：各种维生素、氨基酸、碱基等来源：酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液功能：酶、核酸的组成成分微生物生长必需物质二、微生物的营养类型营养类型能源氢的供体基本碳源微生物举例光能自养型光无机物二氧化碳蓝细菌，绿硫细菌，藻类光能异养型光有机物二氧化碳及简单有机物红螺菌化能自养型无机物*无机物二氧化碳

硝化细菌，氢细菌、铁细菌化能异养型有机物有机物有机物绝大多数细菌和全部真核微生物培养基的配制原则1、目的要明确2、营养要协调浓度(过低、过高）碳源与氮源的比培养基中所含的C源中C原子的摩尔数/N源中N原子的摩尔数例如：谷氨酸发酵C/N=4：1菌体大量繁殖，产生的谷氨酸少C/N=3：1菌体繁殖抑制，产生的谷氨酸多三、培养基3、Ph要适宜细菌：6.5—7.5放线菌：7.5—8.5真菌：5—6根据物理性质分类种类是否含凝固剂（琼脂）用途固体培养基

半固体培养基

液体培养基

有分离、计数有观察运动、鉴定菌种无工业生产种类成分用处合成培养基天然培养基已知化学物质玉米粉、牛肉膏分类、鉴定工业生产根据化学成分分根据用途分类种类原理用途实例选择培养基

鉴定培养基

分离

微生物的特殊营养要求或对其某化学、物理因素抗性某种指示剂与某一菌的无色代谢产物发生显色反应鉴别酵母菌、霉菌、金黄色葡萄球菌大肠杆菌大肠杆菌可以被伊红和美蓝染成深紫色，并带有金属光泽选择培养基加入青霉素的培养基分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基分离自生固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基分离杂交瘤细胞第五节微生物的代谢微生物代谢:微生物细胞内发生的全部化学反应发酵乳糖的细菌在1小时内可分解其自重1000~10000倍的乳糖。产朊假丝酵母合成蛋白质的能力比大豆强100倍，比食用牛强10万倍资料1.若干微生物和动物、植物组织的呼吸速率生物材料消耗O2ul/mg生物干重/hazotobacter固氮菌2000Acetobacter醋杆菌1800面包酵母110肾和肝组织10-20根和叶组织0.5-4代谢特点微生物代谢旺盛的原因：利：生产效率高，生产周期短弊：有害微生物已给人类带来损失和灾害。结论：代谢旺盛体积小，面积大。相对表面积大。（有利于吸收、排泄和信息的交换）微生物的代谢产物：微生物代谢的调节在用葡萄糖和乳糖作碳源的培养基上培养大肠杆菌，开始时，大肠杆菌只能利用葡萄糖而不能利用乳糖，只有当葡萄糖被消耗完毕以后，大肠杆菌才开始利用乳糖。分解葡萄糖的酶是大肠杆菌细胞内一直存在的酶分解乳糖的酶是在乳糖诱导下合成的酶

微生物中的酶组成酶

细胞中始终存在的酶诱导酶环境中某种物质诱导下产生的酶（诱导物：该酶的底物）资料谷氨酸棒状杆菌能够利用葡萄糖，经过复杂的代谢过程形成谷氨酸；但当终产物——谷氨酸的合成过量时，就会抑制谷氨酸脱氢酶的活性，从而导致合成途径中断。当谷氨酸因消耗而浓度下降时，抑制作用就会被解除，该合成反应又重新启动。微生物细胞代谢的调节主要是通过控制酶的作用来实现的调节类型酶合成调节酶活性调节通过酶分子结构的改变来调节变构调节，可逆性。通过调节酶的合成进而调节代谢速率的调节机制，是在遗传学水平上发生的酶合成的调节和酶活性的调节的比较酶合成的调节酶活性的调节调节对象调节机制特点意义诱导酶的合成酶的活性对基因表达的调控反馈性调节间接、缓慢快速、精细避免物质和能量的浪费避免代谢产物的积累微生物代谢的人工控制措施改变微生物遗传特性控制生产过程中的各种条件目的获得更多的代谢产物黄色短杆菌合成赖氨酸过程怎样使黄色短杆菌合成更多的赖氨酸？需要产品赖氨酸

微生物代谢产物在生产中的应用通过培养微生物，获得微生物产生的各种代谢产物，此过程称为发酵。发酵的类型培养基物理状态：固体发酵、液体发酵生成产物：抗生素发酵、维生素发酵、第六节微生物的生长及其控制一、微生物的群体生长：包括微生物的个体生长和微生物的个体繁殖。研究方法以细菌为例将少量同种细菌接种到液体培养基中容积恒定定期检测培养基中细菌群体的生长情况于适宜条件下培养如何测定？微生物生长的测定方法1、测微生物的细胞数目

（1）直接测数法（2）比浊法（3）稀释平板记数法（4）液体稀释培养记数法

2、测微生物的细胞重量（1）细胞干重（2）总氮量测定法（3）DNA测定法（4）代谢活性法微生物群体生长的规律调整期对数期稳定期衰亡期细菌的生长曲线分析生长曲线个阶段的特点细胞分裂细胞数量细胞代谢特点细胞形态特点调整期对数期稳定期衰亡期不分裂不增加代谢活跃、大量合成与细胞分裂有关的物质快速分裂细胞呈指数增长生理特征稳定，代谢旺盛个体形态稳定细胞增加数等于死亡数活菌数达到最高峰大量积累代谢产物，特别是次级产物，营养物质减少（细菌）形成芽孢细胞死亡数大于增加数活菌数下降菌体释放代谢产物细胞多种形态，甚至畸形，开始解体微生物生长曲线的实践意义处于对数期的细菌，生长繁殖速率最快，代谢旺盛生产上常用这个时期的细菌作为菌种，以缩短生产周期。是科研的理想材料;是增值噬菌体的宿主最适菌龄缩短调整期:以对数期细菌作为种子进行接种;适当增大接种量;发酵培养基成分与种子培养基成分尽量接近进入稳定期后，抗生素等代谢产物逐渐增多，生长速率下降到零如果适当补充营养物质，就有助于延长稳定期、提高代谢产物的产量

连续培养连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物应用于乙醇、丙酮、丁醇的生产优点：保证微生物对营养物质的需要；排出部分有害代谢产物；使微生物保持较长时间的高速生长；缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动化管理。缺点：杂菌污染和菌种退化二、影响微生物生长的环境因素

1、温度

（最适、最高、最低）微生物生长最旺盛时的温度叫最适生长温度在最适生长温度范围内微生物的生长速率随温度的上升而加快细胞内的蛋白质和核酸等发生了不可逆的破坏。微生物的生长速率会急剧下降超过最适生长温度以后影响微生物生长的环境因素2、pH每种微生物的最适pH不同多数细菌：6.5～7.5；真菌：5.0～6.0；放线菌：7.5-8.5。影响酶的活性，细胞膜的稳定性等影响微生物对营养物质的吸收等。超过最适pH范围以后影响微生物生长的环境因素3、氧好氧型微生物厌氧型微生物严格厌氧兼性厌氧微生物多种细菌和大多数真菌某些链球菌等某些产甲烷杆菌酵母菌三、有害微生物的控制消毒：利用某些理化因素，杀死物体内外一切病原微生物的措施，但对被消毒物体基本无害灭菌：利用某些物化因素，杀死物体内外一切微生物的措施。防腐：利用某些物化因素完全抑制或停止霉腐微生物生长的措施，以防止食品和其他物品的腐败和霉变。化疗：利用具有高度选择毒性的药物抑制或杀死宿主体内病原微生物的措施，达到治疗疾病的目的。1、物理方法：（1）高温：干热灭菌、湿热灭菌（水煮沸法、高压

蒸汽锅法）、巴斯德消毒法（2）低温：冷藏法、冷冻法（冰箱、干冰、液氮）（3）辐射：紫外线、电离辐射、强可见光（4）干燥和渗透压（5）过滤2、化学方法（1）消毒剂（乙醇）（2）防腐剂（甲醛）控制有害微生物生长的方法：（3）抗生素抑制细胞壁合成：青霉素破坏细胞膜结构：多粘菌素E、段杆菌肽S破坏细菌膜；制霉菌素、两性霉素破坏真菌（外用）抑制蛋白质合成：链霉素、卡那霉素、庆大霉素作用于30S亚基；红霉素、螺旋霉素作用于50S亚基抑制核酸的合成：丝裂霉素C抑制DNA复制；放线菌素D抑制转录；利福平作用于RNA聚合酶（4）抗代谢物：磺胺类药物使细菌生长因子叶酸组成成分对氨基苯甲酸的结构类似物，可取代对氨基苯甲酸与二氢蝶酸合成酶结合，干扰叶酸的正常合成，导致代谢混乱。（5）、微生物的抗药性抗药菌株产生钝化或分解药物的酶；抗药菌株中与药物作用部位结构发生改变；抗药菌株细胞膜通透性发生改变

第七节发酵工程简介密闭式发酵罐微生物学的奠基人——伟大的巴斯德我国的传统发酵产品酱油、醋、腐乳等享誉世界我国的酿酒已经有4000多年的历史我国的酱油距今已有3000年的历史1857年巴斯德证明发酵是由于微生物的作用发酵工程的概念和内容（一）发酵工程的概念采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或者直接把微生物应用于工业生产的一种新技术。发酵工程的概念和内容（二）发酵工程的内容菌种的选育培养基的配制灭菌扩大培养和接种发酵过程产品的分离提纯等一、发酵工程的内容发酵是指利用微生物制造工业原料或工业产品的过程。根据各种微生物的特性，在有氧或无氧条件下利用生物催化(酶)的作用，将多种低值原料转化成不同的产品的过程。如酿酒、制酱和醋等发酵技术古已有之。20世纪40年代中期美国抗菌素工业兴起，大规模生产青霉素以及日本谷氨酸盐(味精)发酵成功，大大推动了发酵工程的发展。70年代以石油为原料生产单细胞蛋白，使发酵工程从单一依靠碳水化合物(淀粉)向非碳水化合物过渡，从单纯依靠农产品发展到利用矿产资源，如天然气、烷烃等原料的开发。80年代初基因工程发展，人们能按需要设计和培育各种工程菌，在大大提高发酵工程的产品质量的同时，节约能源，降低成本，使发酵技术实现新的革命。

１微生物菌体发酵

这是以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。

传统的菌体发酵工业：

有用于面包制作的酵母发酵及用于人类或动物食品的微生物菌体蛋白发酵两种类型。

２微生物酶发酵

酶普遍存在于动物、植物和微生物中。最初，人们都是从动、植物组织中提取酶，但目前工业应用的酶大多来自微生物发酵，因为微生物具有种类多、产酶的品种多、生产容易和成本低等特点３微生物代谢产物发酵

微生物代谢产物的种类很多，已知的有３７个大类,其中１６类属于药物。４微生物的转化发酵

微生物转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。５生物工程细胞的发酵

这是指利用生物工程技术所获得的细胞，如ＤＮＡ重组的"工程菌"，细胞融合所得的"杂交"细胞等进行培养的新型发酵，其产物多种多样。二、发酵工程与工艺控制1、发酵的一般过程菌种的选育要想通过发酵工程获得在种类、产量和质量等方面符合人们要求的产品，最重要的是要有优良的菌种。怎样才能得到优良的菌种呢？如果生产的是微生物直接合成的产物可以从自然界中先分离出相应的菌种，再用物理或化学的方法使菌种产生突变，从突变个体中筛选出符合生产要求的优良菌种。如果生产的是一般微生物不能合成的产品

可用基因工程、细胞工程的方法对菌种的遗传特性进行定向改造，以构建工程细胞或工程菌，从而达到生产相应产品的目的

培养基的配制1）根据不同的菌种，应选择不同的材料配制培养基。配制的培养基应满足微生物在碳源、氮源、生长因子、水、无机盐等方面的营养要求，并为微生物提供适宜的pH。（2）培养基的营养要协调，以利于产物的合成。（3）培养基在满足微生物的营养需求的基础上应尽量降低生产成本，以得到更高的经