德系拉曼长毛兔和白栎兔il-2基因的克隆与序列分析

德系拉曼长毛兔和白栎兔il-2基因的克隆与序列分析

兔子是中国的俗称毛兔子，通常被称为“哈拉兔子”。安哥拉兔远在1765年就为人们所饲养,是世界著名的毛用兔品种。獭兔学名力克斯兔(BreedRex),是世界著名的皮用兔,因其繁殖力高、生产周期短、见效快,具有很高的经济价值。我国上世纪80年代开始普及饲养,目前獭兔存栏量已达2000万只以上,居世界第一。在长毛兔和獭兔养殖过程中,它们对疾病(如:兔出血症、兔巴氏杆菌及兔球虫病等)的抵抗力较弱,且常受到体表寄生虫(如:兔疥螨、蜱类等)的侵害,影响皮毛生产质量。因此,须采取综合性防病措施,提高长毛兔和獭兔成活率,减少疾病危害。目前针对长毛兔和獭兔常见病多采用注射疫苗和抗生素等传统方法治疗,随着抗生素耐药性和传染性病原体变异的不断增加,在兽医领域,用传统疫苗和抗生素控制传染病面临越来越严峻的挑战。由于不断变异的病毒和细菌,出现很多疫苗免疫和抗生素治疗失败的案例。所以,迫切需要发展新型技术克服疫苗和抗生素的缺点,利用细胞因子作为免疫佐剂被认为是安全、经济和有效提高全身抵抗传染病原体免疫水平的方法之一。白细胞介素2(interleukin-2)是由Th1细胞在有丝分裂原的刺激下,且有巨噬细胞存在时(提供IL-1)所产生。以刺激T细胞增生为主,可促B细胞增殖分化、调节NK细胞维持自然杀伤力、诱导淋巴因子活化和淋巴细胞产生等。它能活化机体免疫应答、全面提高机体细胞免疫和体液免疫的功能,是动物体内免疫活性细胞诱导调节作用强且范围最广的细胞因子之一。1983年Taniguchi首次克隆了人的IL-2cDNA,迄今为止,至少有30多种哺乳动物的IL-2基因已被克隆成功。Perkins等首次报道欧洲野兔IL-2基因序列。2007年,黄道超和杨光友等成功克隆出中国白兔IL-2基因。但迄今,长毛兔和獭兔的IL-2基因序列在国内外尚无报道。为此,我们开展了长毛兔和獭兔细胞因子的克隆与真核表达,为长毛兔和獭兔白细胞介素基因的开发应用奠定基础。1材料和方法1.1实验动物3月龄的德系安哥拉长毛兔和白色獭兔(体重约2~3kg)共2只,由四川农业大学兔场提供。1.2细胞沉淀和培养无菌采取健康长毛兔和獭兔外周抗凝血各5mL,在无菌条件下分别加入等量D-Hanks液后,各取5mL缓慢加至等体积的淋巴细胞分离液中,18~20℃2000r/min离心20min。将白细胞层移于另一试管,加等量RPMI1640液,同上条件离心1次,去上清,沉淀物再加入等量RPMI1640液,同上条件离心2次,去上清;沉淀细胞用RPMI1640液轻轻悬浮(含10μg/mLConA、100mL/L小牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素)。取10μL细胞悬液计数后,根据计数结果将细胞悬液稀释至5×106个/mL,分装于细胞培养瓶中,37℃CO2培养箱中培养,于24h、36h和72h取上清,4℃保存备用。淋巴细胞培养24h后,按组织/细胞总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,-70℃保存备用。1.3pcr扩增合成据GenBank中报道的欧洲兔IL-2基因序列(登录号为:AF068057),设计并合成引物。上游引物P1:5-CGCGGATCCGTAACCTCAACTCTTGCCAC-3;下游引物P2:5-CCGCTCGAGTGTTTTGAATGGGAGGTACT-3,其中下划线部分序列为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。引物由上海生物工程有限公司合成。参照TaKaRa公司RT-PCR试剂盒的使用说明书进行反转录合成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸45s,循环扩增35次,最后72℃延伸10min。扩增结束后取2μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。1.4pcr和测序采用QIAquick胶回收纯化试剂盒(TIANGEN公司)回收PCR扩增的目的产物(约500bp),克隆至pMD18-T载体(TaKaRa)中,16℃连接过夜,转化DH5α感受态细胞。采用菌落PCR筛选阳性菌落(扩增条件见1.3)。将鉴定为阳性的菌液送上海英俊生物技术有限公司测序。测序结果采用DNAMAN及MEGA2.0软件进行分析,并与GenBank上已报道的IL-2基因比对分析。鉴定正确的重组质粒命名为pMD-IL-2。1.5双酶切回复突变体dh5大肠杆菌检测用BamHI和XhoI分别对测序鉴定为IL-2基因的阳性质粒pMD-IL-2和pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切,并经胶回收试剂盒纯化酶切产物。回收后的目的片段和载体片段以3∶1的摩尔比进行16℃连接过夜,将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞。采用菌落PCR和双酶切鉴定;将初步鉴定正确的阳性菌由上海英俊生物工程有限公司测序。测序正确的重组质粒命名为pcDNA3.1(+)-IL-2。1.6重组质粒和对照质粒转染cos-7细胞将测序鉴定为IL-2基因的阳性菌和空载体菌经LB培养基培养后,用HighPure高纯度质粒大提试剂盒(TIANGEN公司)提取重组质粒,将抽提的质粒于-20℃保存备用。取第3代培养的COS-7以2×105个/mL密度接种到12孔板,细胞生长汇合率达50%~80%时,按LipofectAMINETM2000Reagent转染试剂盒(Invitrogen公司)操作说明将重组质粒和对照质粒转染COS-7细胞。37℃CO2培养箱中培养5h,用1mL含20%胎牛血清的MEM培养液替换旧转染液,继续培养,24h、36h和72h后取上清,4℃保存备用。据组织/细胞总RNA提取试剂盒说明书提取pcDNA3.1(+)-IL-2和pcDNA3.1(+)质粒转染的COS-7细胞总RNA。按照MBI公司逆转录试剂盒操作手册进行cDNA第一链的合成。取适量第一链产物为模板进行PCR扩增(扩增条件见1.3),并进行琼脂糖凝胶电泳分析。1.7细胞培养和转染按1.2的方法制备兔淋巴母细胞。在6孔培养板中,每孔加入2×107个/mL制备好的兔淋巴母细胞悬液2mL,20μg/mLConA(最终质量浓度为:10μg/mL)的RPMI1640完全培养基1500r/min离心洗涤细胞两次,每次15min。用台盼蓝染色法检测活细胞率后备用。96孔培养板每孔加入RPMI1640完全培养基的靶细胞50μL,再加入步骤1.7中收集的转染后24h、48h和72h的上清液50μL。每个样品设3个重复孔,并设pCDNA3.1(+)空质粒转染细胞培养上清液和PRMI1640完全培养基空白对照,置5%CO2、37℃细胞培养箱培养33h。每孔加入5mg/mLMTT溶液25μL,继续培养3h。每孔加入50μL10%SDS-0.01mol/LHCl溶液,37℃恒温培养箱作用2h。取出培养板,室温下放置20min,用酶联免疫检测仪检测每孔OD570。2结果与分析2.1pcr扩增用设计的引物对长毛兔和獭兔外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到约500bp的条带,与预期片段大小一致(图1)。重组片段经菌落PCR扩增出约500bp的条带,与预期大小相符(图1)。将初步鉴定正确的阳性菌液送公司测序,测序结果经GenBank的Blast在线比对表明序列正确,并在GenBank登录(獭兔和长毛兔IL-2的登录序列号分别为:EF586071和EU639406)。2.2子量和等电点IL-2基因的ORF框均含有462个核苷酸,编码153个氨基酸,其中前20个氨基酸组成信号肽,成熟肽含133个氨基酸残基,预测蛋白分子量和等电点分别约为17.2kDa和6.378。同源性分析结果表明,无论在核苷酸水平还是在氨基酸水平,德系安哥拉长毛兔和白色獭兔IL-2基因序列与GenBank中登陆的欧洲兔及中国白兔的同源基因间的同源性分别为99.4%和98.9%,其次与灵长类动物(猿、人、猕猴和狒狒等)同源基因间同源性较高(表1)。NJ树显示,德系安哥拉长毛兔、白色獭兔与欧洲兔、中国白兔聚类成一支,亲缘关系较近(图2)。2.3约500b的条带pcDNA3.1(+)-IL-2重组体的菌落PCR扩增出约500bp的条带(图3);同时,pcDNA3.1(+)-IL-2经BamHI和XhoI双酶切后得到约500bp的目的片段和约5446bp的载体骨架(图3)。2.4空载体对照il-2的生物学活性检测提取细胞总RNA,经RT-PCR鉴定,结果显示,pcDNA3.1(+)-IL-2转染COS-7细胞后24h、48h和72h均出现IL-2的特征带,而阴性对照和空载体对照未出现IL-2的特征带(图4)。表明pcDNA3.1(+)-IL-2重组质粒在COS-7细胞中能表达基因的片段相应的mRNA。生物学活性检测结果见表2。用SPSS11.5软件分析数据,结果显示:pcDNA3.1(+)-IL-2重组质粒组与pcDNA3.1(+)载体质粒组及空白对照组均有极显著差异(P<0.05);空载体质粒组与空白对照组间无显著差异(P>0.05);不同时间pcDNA3.1(+)-IL-2重组质粒组(24h、48h和72h组)之间无显著差异(P>0.05)。3不同品种兔il-2基因序列的同源性分析本实验根据欧洲野兔IL-2基因序列设计一对特异性引物,克隆得到德系安哥拉长毛兔和白色獭兔IL-2基因的开放阅读框,它们均由462个核苷酸组成,编码一个由153个氨基酸组成的多肽,包括编码20个氨基酸的信号肽和133个氨基酸的成熟肽,预测蛋白分子量和等电点分别约为17.2kDa和6.378。序列分析发现,德系安哥拉长毛兔和白色獭兔的IL-2基因同源性为100%,与欧洲野兔和中国白兔的IL-2基因同源性分别为99.4%和98.9%。与其他物种动物IL-2基因序列同源性对比显示:白色獭兔IL-2基因与灵长类动物(猿、人和狒狒等)IL-2基因同源性较高(同源性大于86.0%),其次分别为猫、马、家犬、猪、大熊猫、水牛、山羊及鼠。构建的NJ树表明,德系安哥拉长毛兔、白色獭兔与欧洲野兔、中国白兔聚类成一支,亲缘关系较近,为研究獭兔白细胞介素2在不同兔品种间的交叉试验提供了参考。IL-2基因具有活化机体免疫应答、全面提高机体细胞免疫和体液免疫的功能,对机体自身免疫调节起着重要作用。将IL-2作为免疫治疗剂,能发挥抗感染、抗病毒、抗肿瘤等作用;将IL-2作为免疫佐剂,可明