工业用微生物菌种课用

发酵工程FermentationEngineering第二章发酵工业菌种本章内容

一、常用的工业微生物二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术三、发酵工业菌种改良最常用的工业微生物细菌醋酸杆菌属制醋工业的菌种乳酸杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌假单胞菌荧光假单胞菌荧光假单胞菌(P.fluorescens)属于假单胞菌属rRNAI群荧光DNA同源组，是植物根际最普遍的微生物类群，具有分布广、数量多、营养需要简单、繁殖快、竞争定殖力强的特点。荧光假单胞菌，而且许多菌株能产生几种活性物质，抗多种植物病害。其作用机制包括：抗生素的作用、噬铁素对铁的营养竞争、有效的根际定殖等。世界许多国家均有人报道分离到抗植物病害的荧光假单胞菌,而且许多菌株能产生几种活性物质,如抗油菜菌核病的菌株。铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）谷氨酸发酵菌种日前用于谷氨酸发酵的菌种有谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、黄色短杆菌、嗜氨小杆菌、球形节杆菌。我国常使用的生产菌株是北京棒杆菌AS1.299、北京棒杆菌D110、钝齿棒杆菌A51.542、棒杆菌S-914和黄色短杆菌T6~T13等。在己报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外，虽然它们在分类学上属于不同的属种，但都有一些共同的特点，如菌体为球形、短秆至棒状、无鞭毛、不运动、不形成芽孢、呈革兰氏阳性、需要生物素做生长因子、在通气条件下培养产生谷氨酸。谷氨酸发酵机制谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经EMP途径或HMP途经生成丙酮酸→再氧化成乙酰辅酶A→然后进入TCA→再通过乙醛酸循环、CO2固定作用→生成a-酮戊二酸→谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下生成谷氨酸谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大生长需要量300多倍的谷氨酸，研究发现：大量积累并非是当初设想的由于特异代谢途径导致，而是：代谢调节控制；细胞膜通透性的特异调节；发酵条件的适合。谷氨酸菌种的定向选育改变细胞膜的通透性：生物素（乙酰CoA羧化酶的辅酶）营养缺陷型株丧失脂肪酸合成酶的油酸缺陷型；丧失a-磷酸甘油酶的甘油缺陷型。选育温度敏感突变株：例：使用典型的温度敏感突变株TS-88生产谷氨酸时，通过控制发酵条件，在生长适当阶段将发酵温度由30℃提高到40

℃，可在生物素含量为33ug/L，含糖3.6%的甜菜糖蜜发酵培养基中，产生20g/L谷氨酸，对糖转化率>55%。生物素对谷氨酸发酵的影响生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶——乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的生物合成，进而影响磷脂的合成。当控制生物素在亚适量时，脂肪酸合成就不完全，导致磷脂合成不完全。而细胞膜是由磷脂双分子层组成的，当磷脂含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出、积累于发酵液中。如果生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸，代谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。生物素亚适量的原因（2ug/L~5ug/L）

：当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。在谷氨酸发酵过程中，影响菌种代谢途径的因素见下表。第36页，共69页防止噬菌体和杂菌的污染谷氨酸生产菌一

般都是生物素缺陷型，而在发酵培养基中又大多是控制生物素亚适量，所以谷氨酸生产菌对噬菌体和杂菌的抵抗能力较弱。最怕污染噬菌体，轻则出现谷氨酸收率低、难提取，重则倒罐，造成很大的经济损失。所以，杂菌和噬菌体的防治工作就显得特别重要。一定要从空气过滤、培养基、设备、环境等环节严格把关。最常用的工业微生物酵母菌酿酒酵母假丝酵母属产朊假丝酵母解脂假丝酵母热带假丝酵母毕赤酵母属、汉逊酵母属：酒精发酵工业及酿造工业的有害菌1、酵母菌形态：酵母菌是一群单细胞的真核微生物,其形态因种而异.通常为圆形、卵圆形或椭圆形。也有特殊形态，如柠檬形、三角形、藕节状、腊肠形，假菌丝等。酵母菌假菌丝:酵母菌在一定条件下培养，产生的芽体与母细胞不分离形成的特殊形态。啤酒酵母的菌落红酵母的菌落各种酵母菌的菌落酵母菌菌落最常用的工业微生物霉菌曲霉属米曲霉黑曲霉青霉属青霉菌：点青霉、产黄青霉桔青霉根霉属德氏根霉米根霉、小麦曲根霉红曲霉属紫红曲霉最常用的工业微生物放线菌链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌未培养微生物定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99％。研究方法①模拟自然培养法:原位培养、培养条件优化、单细胞操作②宏基因组分析法二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求（二）分离筛选原理与技术（三）应用举例

1.菌种选择的总趋势野生菌→变异菌自然选育→代谢控制育种诱发基因突变→基因重组的定向育种

纯净健壮产量质量稳定2易于控制培养条件,周期短3对诱变剂敏感4抗污染力强5原料廉价,生长迅速,目的产物产量高6不是病原菌12、微生物工业对菌种的要求7产物分泌型工业菌种的改良方法解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。增加前体物的深度。改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高深度的有潜在毒物的底物、前体或产品的耐受力。抑制或消除产品分解酶。改进菌种外泌产品的能力。消除代谢产品的反馈抑制，如诱导代谢产品的结构类似物抗性。工业菌种的改良方法（二）分离筛选原理与技术1.筛选的指导思想2.分离筛选工作在实际中应用的几个方面3.

新种分离筛选原理与技术1.筛选的两种指导思想

先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。结果有两种可能：获得适于工业发酵菌株只获得选育所需的出发菌株

2.分离筛选工作在实际中应用的几个方面从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；

生产中长期使用的菌种的定期分离筛选；从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株；从保藏机构获取菌种好处：经济性、指导性从已知菌种和大自然中分离新菌株寻找新的发酵产品的产生菌；寻找老产品的新的优良菌株。国际承认的中国培养物保藏单位武汉大学的中国典型培养物保藏中心CCTCC。保藏了几乎所有的培养物。(CCTCC)国际承认的中国培养物保藏单位中科院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC。保藏有普通菌种。(CGMCC)此外，较著名的中国培养物保藏单位还有中国微生物菌种保藏管理委员会CCCCM——管理机构3.新种分离与筛选的步骤

调查研究（包括资料查阅）

试验方案设计

含微生物样品的采集

（如何使样品中含所需微生物的可能性大？）

样品预处理（如何在后续的操作中使这种可能性实现）

菌种分离

根据目的菌株及其产物特点分

选择性分离方法 随机分离方法

(定向筛选←选择压力)

(用筛选方案-检测系统进行间接分离）

富集液体培养固体培养基条件培养

(初筛)

菌种纯化

复筛

菌种纯化初步工艺条件摸索再复筛生产性能测试较优菌株1-3株保藏及进一步做生产试验某些必要试验和或作为育种的出发菌株毒性试验等

（1）含微生物样品的采集采样时应注意的问题:土壤微生物的分布采土深度：5~25cm土壤植被情况采样季节土壤的酸碱度对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：土壤来源广泛在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种采样1、采样对象以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103）从自然界筛选2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。（2）样品的预处理目的：提高分离效率方法：物理方法：热处理；膜过滤法；离心法化学方法：化学成分增加特定微生物的数量诱饵法：富集目的菌膜过滤法当样品中菌数很低时,可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器,然后将将膜转到相应的培养基上进行培养,对形成的菌落进行统计。例如：放线菌的分离筛选，培养基的组成原则大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。选择性地添加抗生素。分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37℃培养箱中存放3天。放线菌的分离土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。次代培养及纯化菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时显得尤为重要。将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行影印培养，以进一步筛选和分离。（3）分离方法的选择

根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法菌种的营养特征独特

生长特征独特

无选择性特征根据产物的特征进行

随机分离选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。选择性分离

A、选择性分离原理和技术1、生长条件的选择与控制原理控制营养成分

控制培养基酸碱度

添加抑制剂

控制培养温度

控制通气条件

2、选择性分离技术富集液体培养技术固体培养技术施加选择压力，进行定向筛选

①富集液体培养增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件培养方式分批培养方式：以最大比生长速率（μmax）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题连续培养方式：以比生长速率（μ）筛选

μ

ABS0基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响

当S<S0时，富集什么菌株？当S>S0时，富集什么菌株？连续培养方式：以比生长速率μ筛选连续富集培养技术分离菌株的优点

分离的菌株特别适合连续发酵生产过程有利于分离具有某种工业生产特性的菌株可以筛选出能共生的稳定混合培养物

②固体培养技术常用于分离某些酶产生菌

选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质

随机分离原理与技术从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。随机分离技术举例

抗生素产生菌的筛选药理活性化合物产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选多糖产生菌的筛选

高产培养基设计的几个原则

制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素；使用一聚合或复合形式的生长限制养分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物阻遏；确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH缓冲剂以减少pH变化；前体、促进剂及抑制剂的采用。抗生素产生菌的筛选筛选模型：试验菌筛选方法：铺菌法复印平板法液体培养筛选

抗药性筛选筛选模型：氨苄青霉素和β-内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同I II无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性

固体培养筛选试验菌代表微生物类型金黄色葡萄球菌209p革兰氏阳性球菌枯草杆菌6633 革兰氏阳性杆菌 大肠杆菌革兰氏阴性肠道细菌耻垢分枝杆菌607 结核杆菌 白色念珠菌 酵母状真菌 青霉菌

丝状真菌

药理活性化合物产生菌的筛选

药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到治疗的目的。筛选模型：目标酶生长因子产生菌的筛选

筛选模型：营养缺陷型试验菌

筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进营养缺陷型试验菌生长氨基酸产生菌的筛选

样品

预处理

初筛（除真菌）

在分离平板上生长获得多个单菌落复印平板（copy法）

平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸对应到copy前相应u.v线杀死长好的菌落

位置，找到目的菌落

再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂

培养后

产氨基酸菌落周围有生长圈

目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定筛选产物含量高的菌株多糖产生菌的筛选取样特点：碳水化合物工业的废弃物筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。4、几种典型微生物的分离筛选方法举例细菌放线菌真菌细菌分离：以乳酸菌为例

取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中

加麦芽汁至瓶口处，封塞，25℃培养24-48h培养基中长出绢丝状波动物，镜检杆状，阳性染色初步断定乳酸菌

用选择性培养基分批富集培养2-3代稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基

根据透明圈挑选菌落

性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）

Rf值定性（有机酸呈黄斑点）

乳酸生成量测定（滴定法）放线菌的分离：

以产链霉素菌种的分离为例

（从退化菌种中筛选）

取工业发酵液（含孢子）样品1环放入带玻璃珠的装有10ml无菌水的小三角瓶中，摇匀

采用稀释法制平板，获取单菌落

斜面保藏高产菌恢复根据高产菌的特点，选择目的菌落放大培养，发酵液性能测试筛选模型：形态依据真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例

取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7

稀释分离法取0.1ml加入固体培养基铺平皿（×2）

在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h形态筛选根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用

纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次

①生成子囊孢子速度测定 ②发酵力测定性能测定③热死温度测定 ④凝集力测定 ⑤双乙酰含量测定菌种选育改良的具体目标提高目标产物的产量提高目标产物的纯度，减少副产物改良菌种性状，改善发酵过程改变生物合成途径，以获得高产的新产品第二节发酵高产菌种选育常规育种(诱变育种)细胞工程育种基于代谢调节的育种技术基因工程育种蛋白质工程育种代谢工程育种

选择育种方法时综合考虑的因素(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式或连续发酵试验)；(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的明了程度；(3)经济费用。如果对特定菌