中国林蛙抗凝物质的提取及抗凝活性检测

中国林蛙抗凝物质的提取及抗凝活性检测

r.temporiahniew，俗称田鸡和哈什，属于两栖学科，无尾脑。青蛙科是中国特有的经济价值很高的两类药物。它在我国许多地区都有生存,但主要分布在东北地区。经文献检索,目前国内外关于中国林蛙的研究报道,多为林蛙油、雌蛙体的制药及蛙肉的食用等传统的研究范畴,有关中国林蛙深加工的报道很少。前苏联科学家Glazunova指出,冷血动物(龟、蛙、鱼)和鸡的大脑凝血致活酶再钙化值(115～180s)要远远高于温血动物(兔、猪、牛、猫)的大脑凝血致活酶再钙化值(27～95s),其大脑凝活酶的再钙化值即凝血酶原时间(血浆与脑浸液混和,加CaCl2后的凝固时间)。因为所用的血浆和CaCl2相同,而大脑取自不同的动物,所以冷血动物的脑中应含有一种特异性物质,它可以延长血液凝固时间。本试验的研究目的是从中国林蛙头中提取出一种抗凝物质,将其纯化后,对所得较纯提取物进行抗凝活性检测,通过对中国林蛙的综合利用进行深层次的探索,以期开发出一种新的药用或保健产品,以满足提高人类健康水平的市场需求。1材料表面1.1原材料中国林蛙(捕于吉林省通化山区)切头,蛙头在低温(-20℃)下冷藏放置,使用前粉碎。1.2胰蛋白酶法制备胰蛋白酶液由屠宰场收取新鲜猪胰,剔除脂肪组织等异物,切碎,加入等量蒸馏水,按1g胰脏加入1mg胰蛋白酶(Sigma公司产品),在组织捣碎机下制成匀浆,冷藏备用。2抗凝剂的提取和分析2.1抗凝剂提取抗凝物质的提取步骤如下:2.2不同ph的naoh溶液取一定量的粗提物,用1%的NaCl溶液配成5%的水液后,用1ue5fe2HCl调pH为1～2,离心,上清液用NaOH溶液调pH为10～12,按15%量加H2O2,放置4h,保持pH为10～12。离心,上清液用1ue5fe2HCl调pH为6～7,加入等量95%乙醇,冰箱中放置6～9h,离心,沉淀用无水乙醇、丙酮脱水干燥。精提物置于五氧化二磷干燥器中保存。粗提物经氧化脱色、去除杂蛋白,得精提物,精提物为白色粉末,其产率为粗提物的25%。2.3洗脱洗脱物的收集精提物在DEAE-纤维素柱上分别用不同浓度的NaCl溶液洗脱,以95%乙醇检验,天青I溶液示踪,结果用0.8mol/LNaCl溶液洗脱,洗脱体积为760mL时检测洗脱液出现混浊,开始收集。收集物成分较单一,其收集率为55%。该收集物经检测证明为多糖类物质,因此将其命名为林蛙多糖,用TCPS表示,结果见图1。2.4人工诱导系统中各参比酶的检测参照Dietrich法,用0.5%琼脂糖溶液制板(5.5cm×9.0cm),挖孔法加样(加样量0.5μL中含2μg样品),分别采用硼砂缓冲液(0.025mol/L,pH=9.0)、巴比妥缓冲液(0.06mol/L,pH=8.6)2种系统,固定电压160V,电泳1.5～2.5h,以甲苯胺蓝溶液显色。参比样品为肝素。在巴比妥缓冲液和硼砂缓冲液中,TCPS与肝素皆向阳极泳动,斑点集中清晰。结果见表1和图2。2.5抗凝效果和抗凝效果的测定2.5.1标准品与供试品的抗凝活性比较参照兔血浆法。兔心脏穿刺取血后,制成血浆。取管径均匀、清洁干燥的小试管若干,分别加入一定量血浆,置(37±5)℃恒温水浴中预热5～10min后,依次加入一种浓度的标准品或供试品及1%氯化钙溶液后,立即混匀(避免产生气泡),(37±5)℃恒温水浴中放置1h后,取出,用试管法观察血浆凝固情况,分别测出标准品与供试品达到1/2凝固度所需的大致体积数(1/2体积),按下式计算测定样效价:测定样效价=V(s+d)⋅C(s+d)⋅VVsam⋅m=V(s+d)⋅C(s+d)⋅VVsam⋅m式中V(s+d)是标准品1/2凝固度的肝素加入体积(μL);Vsam是测定样品1/2凝固度的肝素加入体积(μL);C(s+d)是标准品肝素溶液的浓度(U/mL);V是测定样品的总体积(mL);m是测定样品称取的质量(mg)。其凝固状况判断标准为:(1)完全凝固:溶液完全凝固,倒转管子并猛敲一下,凝块不从管壁脱落。(2)3/4凝固:溶液完全凝固,但当倒转试管并猛敲一下时,凝块从管壁脱落。(3)1/2凝固:大约一半体积的溶液凝固。(4)1/4凝固:很少溶液是凝固。(5)无凝固:溶液完全流动。肝素、林蛙多糖的抗凝活性比较试验见表2。由表2可知,加肝素的血浆达到的1/2体积为150μL,而TCPS的1/2体积为250μL,由此计算TCPS的效价约为8U/mg。2.5.2应程度与说值碱性染料天青Ⅰ,可与肝素形成“肝素—天青”复合物,并产生一种与原染料颜色不同的颜色反应,这一反应程度与肝素结合量有一定关系。当肝素在低浓度情况下,波长505nm,pH为8.6,其浓度与光吸收值之间符合朗比定律。以肝素为标品做标准曲线(见图3),测TCPS的效价。取0.1mg/mL的TCPS5mL,其吸光度值为0.08,由外标法求得TCPS的效价约为28U/mg。3氨基多糖的抗氧化特性TCPS抗凝试验结果表明:TCPS有抗凝血活性,且其再钙化后的凝固时间要大于同条件下的血浆再钙化时间,但TCPS的抗凝血活性要比肝素低得多。这是因为:第一,TCPS与肝素的SO42-含量不同。从早期K.Meyer试验记载中可以看到:同一原料因制备方法不同则得到的氨基多糖不同,其SO42-的含量变化可从<0.5%到百分之十几。从TCPS的电泳试验结果也可以看出,TCPS中所含的SO42-要比肝素中的少。其次,肝素结构中的N—磺酸与抗凝血作用有密切关系,如遭到破坏,则其抗凝血活性降低。而中国林蛙头中的粗提物在精制过程中,由于使用HCl和发生氧化反应,提取物可能因水解失去N—硫酸残基或氧化降解成酸性产物,导致产物递增地失去抗凝活性。这是在抗凝试验中TCPS的抗凝血作用比肝素小的一个主要原因。理化测定法的抗凝试验的结果比生物测定法的结果要高,这主要是因为凡是聚阴离子氨基多糖,不管其是否具有抗凝活性,均可与碱性染料天青I结合。至于TCPS分子成分、结合方式、各组分含量以及TCPS是否还具有除抗凝血之外的其他生物活性,还有待于进一步研究。4抗凝血活性测定以中国林蛙的蛙头为原料,经碱解、酶解等步骤从其中提取出一种多糖类