金氏痔疮膏对内皮细胞增殖的影响

金氏痔疮膏对内皮细胞增殖的影响

血管生成是一个多步走的过程，包括内皮细胞的殖民化、移民和分化，最后形成基质结构。血管内皮细胞增殖是血管生成的物质基础。血管增生可引发多种疾病,包括心血管疾病、炎性疾病、糖尿病并发症和肿瘤等。内痔是肛垫(肛管血管垫)的支持结构、血管丛及动静脉吻合发生的病理改变和移位。最近有研究表明,痔组织存在显著的新生血管生成,提示血管生成可能是痔发病机制之一,或至少参与了痔的病理生理过程。金氏痔疮膏由本课题组自行研制而成,由大黄、槐花、牛黄、升麻、姜黄、珍珠、冰片等中药组成,具有抗炎、镇痛、止血、消肿等作用,主要用于痔疮的治疗。本实验研究在整方、单味中药水平观察药物对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)增殖的影响,探讨其可能的治痔作用机制。1实验材料1.1青生物工程材料人脐静脉内皮细胞株(ECV-304细胞),购于武汉大学保藏中心;RPMI-1640,购于SIGMA公司;新生小牛血清,购于杭州四季青生物工程材料有限公司;胰蛋白酶、MTT试剂、二甲基亚砜(DMSO),均购自SIGMA公司;血管内皮生长因子(VEGF),购自CYTOLAB公司。大黄、姜黄、槐花、升麻、珍珠、牛黄、冰片、生甘草,均购于温州医学院附属第二医院,药物配比按金氏痔疮膏中比例。1.2仪器ThermoFormaCO2培养箱;DIALABELX800G(Austria)酶标仪。2方法2.1青链霉素的检测细胞复苏后转移至新培养瓶,加入含10%FCS、100µL/mL青链霉素的RPMI-1640培养液,置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中,隔日换液1次,5～7d传代1次,采用0.25%胰蛋白酶消化细胞。2.2中药单味中药的制备VEGF先溶解于双蒸水中,浓度为0.1mg/mL,然后稀释于RPMI-1640培养液,浓度为5µg/L,4℃保存备用。中药采用水煎法,先加6倍蒸馏水,浸泡1h,煎煮(按沸后开始记时)40min,煎液过滤,药渣加水继续煎煮40min,两次煎液合并,减压浓缩至浓度为2g/mL,离心20min后取上清液,高压灭菌后调整pH在7.2左右,4℃保存备用。大黄、姜黄、槐花、升麻等单味中药按相同方法和浓度提取。应用前加入基础培养液中,稀释成不同浓度。2.3细胞悬液的制备取对数生长期的ECV-304细胞,用0.25%胰蛋白酶消化3～5min后,用培养基终止消化,0.4%台盼蓝染色后进行活细胞计数,调整细胞悬液的浓度为1×105/mL,按150µL/孔的体积将上述细胞悬液接种于96孔板,37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中孵育24h。待细胞贴壁后更换新鲜培养液(含基础培养液和不同浓度的药物),每组设6个复孔,同时,每种药物浓度均设空白对照(无细胞组),以除外药物本身对吸光度值的影响,培养48h,加入MTT20µL/孔,继续培养48h后弃去上清液,加入150µL/孔DMSO,室温震荡10min,在490nm波长、参考波长630nm下在酶标仪上测吸光度(A值)。2.4统计方法所得数据用SPSS13.0统计软件进行T检验、方差分析,以P<0.05为相差显著的界值。3结果3.1细胞脱壁药物不同浓度的金氏痔疮膏精提液对ECV-304细胞增殖均有抑制作用,光镜下可见到细胞数量、形态变化;阴性对照显示内皮细胞形成致密单层,细胞为多边形,呈镶嵌状;在0.5g/mL精提液作用下,大部分细胞脱壁,呈圆团状;且呈剂量依赖性(高、中、低浓度药物的抑制率分别为64.1%±4.59%、44.9%±3.59%、28.1%±6.59%)。VEGF对ECV-304细胞增殖有促进作用,在VEGF存在的情况下,金氏痔疮膏精提液对ECV-304细胞增殖仍有抑制作用(高、中、低浓度药物的抑制率分别为49.9%±3.71%、27.5%±6.41%、12.9%±3.83%)。见表1。3.2姜黄糕液对ecv-400细胞增殖的抑制作用高、中,低浓度的大黄煎液对ECV-304细胞增殖均有抑制作用,抑制率分别为54.6%±3.31%、29.9%±3.33%、118.3%±3.51%;高浓度的姜黄煎液对ECV-304细胞增殖有抑制作用,抑制率为14.5%±3.78%,中、低浓度则无抑制作用;槐花、升麻煎液对ECV-304细胞增殖的无明显影响。4非单体药物的血清作用机理内痔是肛垫(肛管血管垫)的支持结构、血管丛及动静脉吻合发生的病理改变和移位。有研究表明,痔组织存在显著的新生血管生成,VEGF表达增加,提示血管生成可能是痔发病机制之一或至少参与了痔的病理生理过程。前期研究表明,金氏痔疮膏具有抗炎、镇痛、止血、消肿等作用;本实验结果表明,金氏痔疮膏具有抑制人脐静脉内皮细胞增殖的作用,在有VEGF的环境下,仍有抑制作用,这可能是金氏痔疮膏治疗痔疮的作用机制之一。在离体细胞培养的研究工作中,自20世纪90年代中期以后,我国对于非单体药物(主要指中药)采用了日本学者在80年代提倡的血清药理方法,即非单体药物通过以人或动物的血清作为载体,使用药物血清来观察该药物的药理作用,模糊地认为该药物血清的药理作用就是该药物的作用,这一方法也渐渐为众多学者接受和采用。使用血清药理方法,可以在一定程度上达到实验用药的稳定,使实验研究得以继续和重复;也可以讲,药物血清在某种程度上更接近药物在机体内代谢及变化的真实水平,但是这一方法的弱点是使一个原本肯定药物的药效,探求药物作用机理的实验研究变得无药物浓度的定量分析和无主要药物成分的定性分析,而且在药物血清中可能已经存在了二次血清效应及器官效应。本实验所用中药采用水煎法,使用时调整pH值,加入量不超过1/4,并设空白对照以除外药物本身对吸光度的影响,最大限度减少药物提取的理化性质对实验的影响。以往的研究表明,大黄素、姜黄素具有抑制血管