植物酵素对酒精性肝损伤小鼠的预防及治疗作用

植物酵素对酒精性肝损伤小鼠的预防及治疗作用

酒精的历史很悠久。随着现代社会经济的发展和社会进步，饮料消费也日益增加。过度消费已成为全社会关注的社会安全问题。据报道,适量饮酒有益于人身体健康,但急性大量饮酒能引起恶心、呕吐、记忆力减退、注意力不集中,严重时可因呼吸肌麻痹而死亡。长期饮酒可导致酒精性肝炎、脂肪肝、肝硬化等严重疾病。因此美国热销解酒药RU21和我国解酒药物解酒保健茶、解酒灵、醒酒肽饮料、茶多福胶囊等解酒保肝类产品的面世对于酒精性饮品日益增多的今天有重要的临床意义和社会价值。酵素类饮品风靡于日本、台湾等地区,受到当地人的广泛青睐,但是其提取工艺略有不同。本实验采用的植物酵素是采用传统的绿色发酵工艺,不添加任何食品添加剂,从50余种新鲜的水果、蔬菜、菌类等植物中提取的酵素精华液,它含有多种营养成分,如低聚糖、黄酮、皂苷、多酚类物质等,具有润肠通便、解酒等作用。本实验以小鼠为研究对象,按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)规定及相关文献研究植物酵素对酒精性肝损伤小鼠是否有预防及治疗作用。1材料和方法1.1试剂与试剂盒植物酵素:吉林敖东大高酵素有限公司,批号110801;乙醇脱氢酶试剂盒、还原型谷胱甘肽试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、谷丙转氨酶试剂盒、谷草转氨酶试剂盒:南京建成生物工程研究所;TG试剂盒:浙江东瓯诊断产品有限公司;阳性对照药联苯双酯滴丸:北京协和药厂,产品批号11090204;力克:辽宁力克制药公司;RU21:美国进口。1.2实验动物昆明种小鼠,雄性,体重18~22g,吉林大学实验动物中心,合格证号:SCXK-(吉)2008-0005。饲料来源同上。1.3实验方法1.3.1酒精性肝损伤模型的建立和指标的测定1.3.1.植物酵素外施液对小鼠口灌胃的影响小鼠按体重,随机分为模型对照组、空白对照组、阳性对照组和低、中、高剂量组,每组10只。其中低、中、高3个剂量组经小鼠口灌胃给予植物酵素剂量分别为10、20、30mL/kgBW,模型对照组和空白对照组给予蒸馏水的剂量为20mL/kgBW,阳性对照组给予联苯双酯23mL/kgBW。动物3d称重一次,按照体重调整受试样品剂量,连续灌胃30d。1.3.1.肝脏组织病理学检测受试样品结束时将模型对照组及各样品组一次灌胃,给予50%乙醇14mL/kgBW,空白对照组给蒸馏水,禁食16h处死动物,取肝脏组织进行各项指标的检测及病理组织学检查。用于检测指标的样本前处理:准确称取待测组织的质量,加生理盐水制成10%的组织匀浆,3000r/min离心10min。然后取组织匀浆上清液,加入生理盐水,稀释成1%组织匀浆,待测。操作过程见各实验试剂盒使用说明。1.3.2预防和处理植物酶1.3.2.灌酒时效试验取40只雄性昆明种小鼠,随机分成模型组、实验组、阳性药物Ⅰ组、阳性药物Ⅱ组,每组10只。4组小鼠先禁食12h,自由饮水再进行如下实验处理:实验组灌胃植物酵素0.2mL/10gBW;模型组灌胃生理盐水0.2mL/10gBW,阳性药物Ⅰ组灌胃力克0.2mL/10gBW,阳性药物Ⅱ组灌胃RU21284.2mg/10gBW。给药30min后各组分别灌胃50°白酒0.165mL/10gBW。灌酒后记录各组小鼠醉酒数、死亡数、醉酒耐受时间(从灌完酒到翻正反射消失时间)和醒酒时间(从翻正反射消失到恢复所需的时间)。小鼠醉酒与否以翻正反射是否消失为标准:小鼠灌酒后将其背向下轻轻放入动物笼,若动物背向下的姿势保持30s以上,则认为翻正反射消失,即为醉酒。1.3.2.植物酵素饮料的配制取40只雄性昆明种小鼠,随机分成模型组、实验组、阳性药物Ⅰ组、阳性药物Ⅱ组,每组10只。4组小鼠先禁食12h,自由饮水,先灌胃50°白酒0.165mL/10gBW,再进行如下实验处理:实验组灌胃植物酵素0.2mL/10gBW,模型组灌胃生理盐水0.2mL/10gBW,阳性药物Ⅰ组灌胃力克0.2mL/10gBW,阳性药物Ⅱ组灌胃RU21284.2mg/10gBW。灌药后记录各组小鼠醉酒数、死亡数、醉酒耐受时间和醒酒时间。1.3.3酒精性肝损伤依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)酒精性肝损伤检验方法及文献报道。实验数据用方差分析进行统计处理。各组数据用ue0af±s表示,P<0.05为差异显著,具有统计学意义。2结果与分析2.1小鼠体重的变化由表1可见:喂养前,动物随机分组,各剂量组间的小鼠体重没有显著性差异;喂养30d后,给予酵素的剂量组的体重与模型组比较有差异性,可能是酵素中糖类物质使小鼠有饱腹感,进而进食量减少,体重减轻。2.2肝谷草转氨酶got和谷丙氨酸转氨酶pgt的活力结果和分析2.2.1标准got曲线2.2.2标准的pgt曲线2.2.3肝脏组织损害由表4可见:与正常组比较,模型组GOT、GPT水平明显升高,说明过量的酒精摄入会引起肝脏组织损害。与模型对照组比较,阳性药物(联苯双酯)组和高、中、低剂量组的GPT、GOT活力显著低于模型组,表明植物酵素和联苯双酯均可降低肝组织中GPT、GOT酶活力,减少酒精对肝组织的损伤,从而在一定程度上抑制GOT、GPT活性升高。2.3模型小鼠adh活力乙醇可以使肝脏ADH活性下降。由表5可见:模型对照组小鼠经口灌胃50%乙醇,建立小鼠酒精性肝损伤模型,该模型组小鼠的ADH活力相比较空白对照组不显著,表明该酒精性肝损伤模型不成立,可能与给予酒精时间较短有关,实验中并未造成严重酒精性肝损伤。与模型组小鼠比较,植物酵素剂量组可明显升高肝组织ADH活性,升高85.2%(P<0.05),说明植物酵素可通过提高肝组织ADH活性促进酒精代谢、降低酒精浓度,起到解酒的作用。2.4酒精性肝损伤模型由表5可见:模型对照组小鼠经口灌胃50%乙醇,建立小鼠酒精性肝损伤模型,该模型组小鼠血清中的甘油三酯(TG)含量显著高于空白对照组,表明该酒精性肝损伤模型成立。但是各剂量组及联苯双酯阳性药物组小鼠血清中的甘油三酯(TG)含量与模型对照组比较相差较小,T检验结果不显著,可能是一次性灌胃酒精对于小鼠血清中的脂蛋白影响较小,故结果差异不明显。2.5小鼠酒精性肝损伤模型的建立小鼠摄入酒精后会激活氧分子,产生氧自由基导致肝细胞膜的脂质过氧化。由表5可见:模型对照组小鼠经口灌胃50%乙醇,建立小鼠酒精性肝损伤模型,该模型组小鼠的MDA含量相比较阴性对照组不显著,表明该酒精性肝损伤模型不成立。可能是因为一次性灌胃酒精的含量对小鼠的肝组织造成脂质过氧化损伤不明显,因此该酒精性肝损伤的模型不成立。2.6造模损伤程度参照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)病理切片评分标准,结果分析得出:造模损伤程度较轻,不能充分拉开距离;结果需要与生化相结合。2.7植物酵素对小鼠酒精神的影响预防实验中小鼠的实验处理为先给药后灌酒,结果如表6所示。实验组醉酒耐受时间极显著高于模型组,阳性药物Ⅰ组、阳性药物Ⅱ组相对于模型组比较,结果不显著(P>0.05),但是耐受时间相对延长,说明植物酵素可以有效延迟醉酒;实验组醒酒时间与模型组比较明显减少了44.9%(P<0.01),这说明植物酵素的解酒效果较佳;比较4组的醉酒率和死亡数也能看出植物酵素对醉酒小鼠具有明显的保护作用;此外,阳性药物Ⅰ组和Ⅱ组在解酒方面效果不佳,其可能的主要作用是修复肝损伤。治疗实验中小鼠实验处理改为先灌酒后给药,结果如表7所示。植物酵素组醉酒耐受时间极显著高于模型组,阳性药物Ⅱ组醉酒耐受时间显著低于模型组,其耐受时间较短;植物酵素组醒酒时间极显著高于模型组,醒酒时间显著缩短30.5%,阳性药物Ⅰ组、阳性药物Ⅱ组的醒酒相对于模型组不明显,醒酒时间相对较长。以上结果说明植物酵素的解酒效果良好,阳性药物Ⅰ组和Ⅱ组在解酒方面效果不佳,其可能的主要作用是修复肝损伤。3不同植物酵素对肝损伤的保护作用肝脏的受损伤程度的一个重要标志就是生化指标的变化。转氨酶主要分布在肝脏和心肌中,是代谢过程中人体必不可少的酶,正常肝组织内GPT含量约为血中的100倍。当肝脏实质性损害时,只要有1%的肝细胞坏死就可使血清活性增加1倍,从而导致GPT、GOT升高,因此转氨酶是肝细胞损害的敏感标志,也是乙醇所致肝损伤最敏感的指标。TG是反映肝脏脂肪代谢障碍的敏感指标,MDA是脂质过氧化的最终产物,反应机体脂质过氧化的严重程度,从而间接反映细胞的受损伤程度。乙醇脱氢酶(ADH)是人体分解乙醇的主要酶类,主要分布于肝脏。在乙醇被机体吸收后,在ADH的催化下可被脱氢氧化为乙醛,乙醛具有很强的毒性,是导致肝损伤的直接作用者。ADH分解酒精的速度主要与ADH的量有关,血清中ADH的水平可以反映体内酒精代谢的情况,目前大部分解酒药物也正是基于这一机制开发的。由上述实验结果可以看出