相对和绝对定量同位素标记iraq技术的研究进展

相对和绝对定量同位素标记iraq技术的研究进展

完成人类的环境研究，成功地将人类的重点转向了整体的生物功能研究。然而，由于基因组学本身的局限性，它无法回答蛋白质的表达时间、表达水平、翻译后的性能、蛋白质与其他生物分子之间的相互作用等问题。自1994年澳大利亚立大利全学的韦勒斯和韦勒斯首次提出了蛋白质组学的概念以来，蛋白质组学在科学生活和医学研究领域蓬勃发展。许多科学家正在进行大规模的蛋白质组文献，并将蛋白质组的系统识别和定量为主要目标。由于蛋白质浓度对其功能的实现起着非常重要的作用。如果特定物质的浓度发生变化，细胞的激活过程可以显示。同时，许多蛋白质生物标记也会根据丰富的含量变化来决定特定物质或疾病的发生。因此，测量蛋白质的相对固定浓度非常重要。近年来，随着高流量蛋白质组的仪器、试剂和技术的进步，同时识别和比较疾病的发生以及疾病治疗的蛋白质水平可能会发生。相对固定量化指数（itraq）是美国应用生物系统公司2004年开发的一种新的外部相位标记技术。该技术可以找到不同的表达蛋白，分析其蛋白质功能，同时准确定量和鉴定各组表达的所有蛋白质或所有复杂混合系统中的所有蛋白质。目前，itraq技术在定量研究中得到了广泛应用。1itraq定量方法iTRAQ技术使用8种(或4种)不同的同位素试剂来同时标记和比较8种(或4种)不同的蛋白质样品.以8种不同的同位素试剂为例,这些试剂(Fig.1)由3个不同的化学标签组成:标签分子分别由质量为113、114、115、116、117、118、119和121的报道基团(reportergroup),质量为192、191、190、189、188、187、186和184的平衡基团(balancegroup)和1个相同的反应基团(reactivegroup)组成.肽反应基团将iTRAQ标签与肽段的N-端基团和每个赖氨酸侧链相连,可标记所有酶解肽段,在其上8种报告基团通过平衡基团与反应基团相连.报告基团和平衡基团的平衡分子量都为305,因此改变任一iTRAQ试剂,不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测,分子量都完全相同.而在串联质谱中,同重元素标记肽段自Fig.1所示虚线部分裂解,平衡基团在二级质谱发生中性丢失.信号离子表现为不同质荷比(113~121)的峰,因此,根据波峰的高度及面积,可以得到蛋白质的定量信息.iTRAQ技术的大体流程如Fig.2所示.样品一般先经胰蛋白酶裂解、烷基化、酶解为肽段,所产生的肽段用iTRAQ试剂多重标签进行差异标记,再将标记样本相混合,最后用LC-MS/MS进行分析.每一个iTRAQ实验都会产生成千上万个光谱,数千个可识别多肽和上百个可鉴定蛋白.因此,生物信息学的工具和分析方法对于分析和解释这些数据是必不可少的.许多新近开发的数据管理和分析工具可以用来分析这些庞大的数据.如ProQuant、ProteinPilot等由iTRAQ试剂制造商提供的软件及其它大量免费软件.2基于质谱的定量技术目前,蛋白质组学研究中应用的比较成熟的定量方法主要有两种.一种基于传统双向凝胶电泳及染色,另一种基于质谱检测技术.目前,应用比较广泛的双向电泳技术主要是双向荧光差异凝胶电泳(two-dimensionalfluorescencedifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE).但由于双向电泳本身的弊端,其对蛋白质的分离受到蛋白丰度、等电点、分子量和疏水性等的限制,对于低丰度蛋白、极大(相对分子质量>200kD)和极小蛋白(相对分子质量<8kD)、极碱性蛋白和疏水性蛋白都难以进行有效分离.因此,限制了其应用范围.而iTRAQ技术可以对任何类型的蛋白质进行鉴定.此外,双向凝胶电泳操作费时费力,难以实现和质谱的直接联用,不易自动化.基于质谱的蛋白质组学定量技术可以分为两大类:标记定量技术(labelingquantitation)和非标记定量技术(label-freequantitation).而前者则可更细分为体内标记(invivolabeling)技术和体外标记(invitrolabeling)技术.标记定量技术可通过使用代谢标记(metaboliclabeling,15N标记)、同位素编码的亲和签(isotope-codedaffinitytags,ICAT)和在培养过程中使用稳定性同位素标记的氨基酸(stableisotopelabelingofaminoacidsinculture,SILAC)等来区别两种不同样品的蛋白质,后再通过质谱进行含量比较.iTRAQ标记相比ICAT/SILAC等主要有以下优点:第一,标记发生反应,单肽来自于自由的氨群(在氨基酸N端的每个肽或在侧链上的赖氨酸),因此相对定量化;第二,作为标记的反应不在活细胞,它适合所有类型的蛋白质样品,而不像SILAC,不能对组织来源的蛋白质进行分析;第三,iTRAQ标记目前可使8个样本同时相对量化,大大降低了实验过程中所引入的技术误差,而ICAT标记只限于2个样本,SILAC至今只有3个被使用.本文对目前已有的同位素标记技术进行了比较,其结果如Table1所示.非标记定量法是最近才提出的应用于定量蛋白质组学研究的新方法.它包括基于色谱峰面积定量法及利用二级离子信号的强度进行的MRM(多反应监测)检测等.非标记定量法不需要同位素标签做内部标准,具有经济、高通量和省时省力等优点.然而,这种技术比较依赖于仪器的状态、样品的复杂性以及一些未知因素.由于目前质谱技术水平的限制,非标记定量法的灵敏度和准确性都比不上标记定量法.标记定量法将离子抑制效应、背景噪音和仪器条件等系统误差的影响降到了最小.基于以上优点,iTRAQ技术已成为目前蛋白质组学定量方法中一个十分重要的技术,其作用已经在许多生物体和组织研究中得到证明,其优越性也在逐步地凸显.但iTRAQ技术本身的某些性质也制约了它的应用,比如iTRAQ试剂几乎可以与样本中的所有蛋白结合,容易受样本中的杂质蛋白及样本处理过程中缓冲液的污染,需要对样本进行预处理并尽量减少操作过程中的污染.此外,目前iTRAQ试剂仍非常昂贵,这也一定程度制约了它的广泛应用.3itraq的应用iTRAQ技术自2004年开发以来,以其独特的优势在蛋白质组学定量研究中得到了广泛的应用.目前,它可以同时对多达8种样品进行分析,且应用范围广.下面就iTRAQ技术近几年在生命科学领域的一些应用做一简单的介绍.3.1硝酸盐胁迫对抗氧化酶系统的影响Zhou等将iTRAQ技术引入到抗菌肽的研究中.他们使用iTRAQ结合多维液相色谱和串联质谱联用技术,研究经最小抑菌浓度下的人源中性白细胞抗菌肽HNP-1处理后大肠杆菌的细胞变化.研究结果表明,一些参与糖酵解过程的蛋白酶含量丰度降低了.相反,许多蛋白如AceE、AcnB经HNP-1处理后含量丰度都显著提高了,而这些蛋白很有可能与抑制反应的补偿性应答有关.他们认为,这些蛋白含量丰度的增加或降低可能是由于抗菌肽的抗菌作用而引起.所以,这些蛋白可以作为筛选更具抗菌活性的抗菌肽的靶蛋白.Redding等采用iTRAQ技术分析了硝酸盐胁迫对DesulfovibriovulgarisHildenborough(DvH,一种硫酸盐还原细菌)细胞蛋白质组成的影响.共有多达737种蛋白质被检测得到.这些蛋白质占DvH总蛋白22%,分布于各种功能范围.分析结果表明,在硝酸盐胁迫下,中枢代谢和硫酸盐还原途径中的蛋白质没有出现较大的变化,但硝酸盐还原代谢通路相关的蛋白含量有所增加.其中,脯氨酸、甜菜碱和谷氨酸转运系统的蛋白质含量提高,氧应激反应蛋白、大量ABC转运系统及含有铁硫簇蛋白相对含量也有上调.此外,大量假想蛋白质的含量也发生了显著变化.该研究为硫酸盐还原菌应激反应机制的研究奠定了基础.3.2itraq在活性成分分析和分子鉴定中的应用Golovan等利用iTRAQ技术处理了猪肝细胞中的1476种蛋白,对其中880种蛋白进行分析,在错误识别率小于5%条件下,他们发现一些与能量代谢、分解代谢、生物合成、电子传递、氧化还原酶类反应等有关的蛋白含量都大大增加了,这些蛋白在肝脏作为化学和能量工厂这一角色中都起着重要的作用.同时,他们还将人类、小鼠和猪的肝脏蛋白进行了比较分析,发现三者80%蛋白都是一样的.另外,他们还发现,动物的性别或经转基因引入1个异常的植酸酶都会对猪5%肝脏总蛋白产生影响.当使用qvalue将错误发生率(FDR)控制在0.1%以内时,就只有4种蛋白在性别差异上表现出不同,2种蛋白在品系(转基因/传统)中表现出不同.该研究有助于人们更好地了解不同动物肝脏蛋白质组的差异.同时,这一研究还可为改善猪肉品质、人类疾病和异种器官移植等研究提供理论依据.Zhu等使用iTRAQ技术鉴定了芸苔属植物保卫细胞中的相对蛋白成份.他们用相对定量的方法在经脱落酸处理过的样品中和对照组中鉴定出431种蛋白质.在含量丰度相对上调的66种蛋白质中,与应激和防御有关的蛋白占大多数.38种蛋白的含量丰度下调了,其中许多都与新陈代谢和蛋白合成有关.也未曾有人报道过这些蛋白与脱落酸敏感或与气孔的开合有关.他们的研究不仅建立了一个完整的脱落酸敏感蛋白库,而且鉴定出几种新的蛋白,为后续研究其在植物保卫细胞中的功能奠定了基础.抗药性是目前胃癌治疗的一个主要瓶颈,其复杂的抗药机制还未被完全了解.为了阐明胃癌的分子抗药机制,Hu等首先将iTRAQ技术引入了胃癌抗药性机制的研究中.他们以抗长春新碱的SGC7901/VCR细胞系和其亲本细胞系SGC7901为研究对象,使用iTRAQ结合LC-MS/MS技术进行分析,共发现820种蛋白质,其中91种蛋白在SGC7901/VCR和SGC790中表达有差异.使用Western印迹技术进一步验证了许多表达上有差异的蛋白,最终证实SGC7901/VCR中的MVP蛋白和抗药性有关.这一研究表明,iTRAQ技术在识别癌症细胞蛋白表达差异上具有很好的效果.3.3其他特殊蛋白的诱导表达脑脊髓炎及多发性硬化症是目前常见的脑部疾病.蛋白酶和肽酶是重要的细胞功能调节阀,蛋白酶的异常活动可能会导致一些脑部疾病的发生.Jain等使用iTRAQ技术研究了经鸟枪法处理后的无胰蛋白酶和部分含有胰蛋白酶的多肽,来比较正常的和实验性自身免疫性脑脊髓炎鼠腰部脊髓的蛋白酶组成变化.他们发现了许多蛋白质如:α1-巨球蛋白(一种蛋白酶抑制剂)、α1B-糖蛋白、β2-微球蛋白、染色光多肽、硫化糖蛋白1等.这些蛋白经iTRAQ试剂处理后,其含量在两种细胞中发生了变化.这表明,这些蛋白可能作为蛋白水解物的标志物,这些水解产物是由自身免疫性脑脊髓炎中改变的蛋白酶所催化水解的.经随后的Western印迹实验证实,在实验性自身免疫性脑脊髓炎组织中,的确存在特殊的蛋白质的分裂调节异常.另1个蛋白水解变化发生在α2-巨球蛋白.同时,他们还发现了另1个与α1-巨球蛋白类似的蛋白酶抑制剂.这一研究结果表明,在动物体内正常的神经元水解蛋白过程和实验性自身免疫性脑脊髓炎内源性的蛋白水解调节是不同的.这些研究结果可能作为以蛋白酶抑制剂为基础的治疗多发性硬化症的基本原理.Muetzelburg等用iTRAQ和质谱串联技术识别了能指示经肉毒杆菌C3胞外酶处理的神经元细胞的细胞组成变化的生物标记物.他们一共鉴定出355种不同的蛋白,其中135种可以定量.发现经C3胞外酶处理后,55种蛋白的含量发生了改变,其中44种蛋白的含量丰度有较大提高,仅11种蛋白质含量丰度降低了.这些蛋白包括α-2-HS-糖蛋白、巨噬细胞游走抑制因子、染色体蛋白5、核纤层蛋白A/C、锌指结构蛋白ZFPM1、HSP27等,其中许多蛋白都有可能成为指示经C3胞外酶处理后,细胞组成变化的候选生物标记.3.4itraq标记检测细胞中高丰度蛋白的检测血浆被认为是一个很有前景的与疾病相关的生物标记物.由于血浆浓度范围的复杂性和动态性仍是如今这一研究的主要障碍.因此,开发能够识别新的血浆生物标记物的蛋白质组学方法是很有必要的.Ye等分别用免疫耗竭和蛋白均衡器去除高分度蛋白技术将血浆蛋白进行预处理,随后用8杯的iTRAQ技术进行标记,最后用强阳性离子交换树脂结合液相色谱和质谱联用技术分析.研究结果表明,两种预处理方法在识别蛋白数量上是互补的.好的色层析技术对于进一步分离经iTRAQ标记的多肽是非常重要的.两种预处理方法各自识别出320和248种不同的蛋白,其中包括大量的生物功能蛋白和动态范围在107内的蛋白.Tonack等提供了一个技术上更加详细的以iTRAQ技术为基础的量化血清蛋白中高丰度蛋白的免疫耗竭的方法.他们对标准的iTRAQ实验方法做了改良,包括在进行iTRAQ标记时将三乙胺碳酸氢钠缓冲液改为碳酸氢钠缓冲液,在检测时混合每个样本的复制标签.用这种经改良的方法检测胰腺癌样本,共鉴定出217种蛋白(5773种多肽),其错误发生率小于1%,254种蛋白测定的置信度大于95%.共获得了234种蛋白(置信度95%)血清蛋白的定量数据,其中包括组织泄漏浓度范围内出现的蛋白种类.试验结果表明,iTRAQ技术在检测组织泄漏范围内的蛋白具有很高的敏感性.4临床治疗药物随着人类基因组计划的完成,生命科学研究已进入了后基因组时代.蛋白质组学的研究已成为当今生命科学研究领域中的一个重要分支.该技术可用于寻找和发现区别于正常生理状态下的疾病特异表达蛋白,这有